一、基本原理

Western Blot 即蛋白免疫印迹，是等量上样的蛋白样品通过电泳按分子量分离蛋白质、再转移到合适的膜上，然后通过特异性抗体对膜上的目的蛋白或特定位点修饰进行结合和识别，经过抗体偶联的显色或显影系统获得条带结果，通过分析条带位置和深度来分析目的蛋白或特定位点修饰的水平。

二、步骤

（一）由蛋白样品制备；制胶、上样、电泳；转膜；封闭、抗体孵育；曝光五个步骤组成，其简要流程如下：

详细实验步骤：

1.蛋白样品制备

1.1蛋白样品制备选择合适的裂解液

根据蛋白性质不同，选择裂解液也不同，常用产品名称：①RIPA裂解液②NP-40裂解液③SDS裂解液

区别：   

 1.2蛋白浓度测定（BCA法）

①配制蛋白标准品

取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管（20mgBSA）蛋白标准管中，充分溶解后，配置成25 mg/mL的蛋白标准溶液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。

取适量25 mg/mL蛋白标准溶液，用PBS或去离子水稀释至终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。   

②绘制标准曲线（酶标仪法）

将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加入到96孔板中，加稀释液补足到20μL 。加适当体积样品到96孔板孔中，如果样本不足20μL,需加稀释液补足到20μL。注意记录样品体积。

③配制BCA显色液

根据样品数量, 配制BCA 工作液，按50体积 BCA 试剂 A 加入1体积 BCA 试剂 B (50:1）配置适量 BCA 工作液，充分混匀。BCA 工作液室温24h内稳定。每个待测样品需200 μL，建议按需配制，避免浪费。

④酶标仪检测

向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色液200 μL，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

⑤计算

根据绘出的标准曲线及所测样品的吸光值，计算出样品实际蛋白浓度。

1.3蛋白变性

按照体积，加入Loading Buffer 并混匀，95℃加热变性10min，置于-20℃冰箱储存。

1.4本实验室贴壁细胞提蛋白步骤（蛋白提取试剂盒：invent Total Protein Extraction Kit for Animal Cultured Cells and Tissues SD-001/SD-002）此步骤仅供参考，具体以自己所用试剂说明书为准。   

①样品间数量保持相对一致的T25细胞培养瓶，加入SD-001，500μl，冰上充分裂解10min，刮取细胞裂解液。

②移入预冷的柱子中，12000rmp,离心30S。

③弃去柱子，将蛋白置于冰上。

④进行蛋白浓度测定，BCA法，详细步骤见上文（本实验室所用试剂盒：碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒。具体以自己所用试剂说明书为准。）

⑤按照提取蛋白的体积，加入适量Loading Buffer 混匀，开水煮10min，置于-20℃冰箱储存。

2. 制胶、上样、电泳

2.1制胶

2.1.1浓缩胶、分离胶浓度的选择

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，凝胶由两种不同的凝胶层组成，上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.7，胶浓度通常为5%；分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9，分离胶浓度需要根据蛋白分子量大小，选择不同浓度的分离胶用于实验。

2.1.2本实验室制胶步骤（以Servicebio 10%PAGE彩色凝胶超快速配置试剂盒为例）此步骤仅供参考，具体以自己所用试剂说明书为准。

①把玻璃板洗净晾干→对齐玻璃板(短板在前，长板在后)→放入制胶架子中，两侧夹子卡紧，下端与桌面垂直→将制胶架子放在塑料架上固定好。

②加满超纯水，检测是否漏液(静置几分钟后检查，无漏液，倒掉，倒置晾干或用无屑纸吸干)。

③配制体系

a.取两只50ml离心管，分别将下层胶A、B液按说明书比例倒入混匀，上层胶A、B液倒入混匀

b.先配下层胶:加入同比例的促凝剂（10%AP），混匀，用巴氏管或移液枪沿玻璃加入，加到绿带下线即可，注意要匀速，不要产生气泡。

c.加无水乙醇液封，加满(动作轻柔，不要产生气泡)，等待下层胶凝固(20-30min/离心管中剩余的是否凝/也可通过观察，会有折线出来提醒已经凝固)。

d.倒掉上层无水乙醇(倒置晾干或用无屑纸吸干)。

e.配制上层胶:加入同比例的促凝剂（10%AP），混匀，将剩余空间加满(上层胶比较容易凝，加的时候要快速一点，但是不要有气泡)，将梳子插入上层胶中(加完上层胶后立即插入，注意倾斜角度插入避免气泡产生)。

f.待上层胶凝固。

④配液:    

running buffer:一包粉剂配1L超纯水，用于跑胶，还可用于配好的胶板的保存。

Transfer buffer:一包粉剂配800ml超纯水+200ml甲醇，用于转膜，配好后4度预冷。

TBST:一包粉剂+2L超纯水+2ml洗涤剂Tween-20，用于洗涤。

2.2上样:

①根据分组和定量结果上样，上样前先加热煮沸，然后离心

②双手缓慢垂直拔出梳子，并将RunningBuffer倒入内外槽中,形成闭合回路。内槽 Running Buffer需注满，外槽RunningBuffer没过最低刻度线即可。

③用移液器吸取样品，垂直上样，将枪头置于两块玻璃板之间上样泳道的位置，轻轻插入其中（不能用力插入，挤压玻璃板），缓慢打出样本，待样本全部打出时，停顿2秒再拔出枪头，保证样品全部加入上样泳道。

④记得上marker

2.3电泳:

①上样完以后，连通电泳仪电源,注意正负极连接正确（黑对黑，红对红）

②设定适宜的电泳参数(以10%为例，浓缩胶电泳参数为恒压60V，30min;待样本进入分离胶时,可将电泳调至120V,60min)。

③当溴酚蓝到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。

3.转膜    

SDS-PAGE凝胶中的蛋白因结合SDS而带负电荷，在电场的作用下，带负电的蛋白会转移到膜上。

3.1膜类型的选择

3.2转膜条件的选择

3.3本实验室转膜步骤。此步骤仅供参考，具体以实际为准。   

3.3.1准备工作

a.转膜液至少提前2h（即开始电泳后）放入﹣20℃冰箱预冷。

b.目的蛋白＞20KD选择0.45μ m NC 膜；目的蛋白＜20KD选择0.2μ m 的 NC 膜或0.22μ m 的 PVDF 膜，选择完毕后将 NC 膜放在 Transfer Buffer 中浸泡备用，如使用的是 PVDF 膜需先放入甲醇中浸泡2-3min，再放入Transfer Buffer 中浸泡备用。

3.3.2转膜

取出玻板中的凝胶，在夹板上依次放一块黑色海绵垫、两张滤纸、凝胶、NC 膜、两张滤纸、一块黑色海绵垫（"三明治"结构），将转好的膜放在转膜槽，再放进电泳仪中的时候黑板对黑面，白板对红面，其中电泳仪内放一块冰盒，将电泳仪置到冰盆内，倒满Transfer buffer，调到恒A 300mA转膜1h:

3.4丽春红染色（可选）

带负电荷的丽春红染料能够与膜上带正电的氨基酸发生可逆结合，以判断转膜效率。

转膜后将膜用丽春红染色，染色后将膜裁剪，保留目的条带，用TBS 洗三遍(每次5min.80r)，以去除染色，再进行后续膜封闭及抗体孵育。

4.封闭、抗体孵育

4.1封闭

蛋白转膜后，膜上尚有未结合蛋白的部位，可以采用封闭液进行封闭，以减少非特异性结合。   

4.1.1封闭液选择

①脱脂奶粉：通常封闭液的浓度为 2.5-5% （w/v）。经济实惠，封闭效果较强；缺点：目标蛋白是磷蛋白的话会有很多背景信号。即使目标蛋白不是磷蛋白，因为是蛋白质的混合物，也容易产生较高的背景信号。

②牛血清白蛋白(BSA)：是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，通常含有BSA的封闭液的浓度为2-5%（w/v）。缺点：价格高，提纯过程中有可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白都可以和哺乳动物抗体产生交叉反应，会增加非特异性背景信号。

③商品化封闭液：通常含有提纯过的蛋白，里面不含有磷蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、生物素 等其他封闭液中难以避免的成分。每个商品化封闭液都有自己的Protocol，封闭时间很快。

4.1.2本实验室封闭步骤

将膜取出，放入合适的孵育槽中，快速封闭液（ NCM Bioth NcmBlot Blocking Buffer 快速封闭液）封闭30-60min，用TBST洗三遍(每次5min.80r)

4.2抗体孵育

一抗识别膜上蛋白或修饰性抗原表位，二抗识别一抗恒定区从而与一抗结合，最终通过二抗携带的荧光或酶显色信号，达到对样本中目的蛋白进行检测的目的。一抗孵育推荐4℃过夜，可以提高抗体结合效率，并有助于降低背景；二抗一般为室温孵育。

4.2.1内参选择    

   胞浆和全细胞蛋白：GAPDH（37 KD），β-actin（43 KD），Tubulin（55 KD）

   胞核蛋白：PCNA（29 KD），Histone H3（17 KD）

   核膜蛋白：lamin B（66 KD）

   线粒体蛋白：COX IV（17 KD），VDAC1（30 KD）  

4.2.2单克隆抗体和多克隆抗体选择

抗体分单克隆抗体（monoclonal antibody, MAb）和多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）。

单克隆抗体是只能与特定的、单一抗原结合的抗体，而多克隆抗体是能与一种以上抗原结合的抗体。单克隆抗体特异性明显强于多克隆抗体。在WB实验中使用单克隆抗体检测目的蛋白，多呈单一的、清晰条带，实验结果良好；而使用多克隆抗体可能导致多条带或条带不清晰，实验结果质量欠佳。

4.2.3抗体种属选择

①目标蛋白的种属：首先确定要检测的目标蛋白所属的物种。如果样品来自人类，那么选择来自其他物种的抗体，如小鼠、兔子或羊等，因为这些抗体通常对人类蛋白有较高的特异性。

②一抗种属：选择与样品来源不同种属的一级抗体。例如，如果样品来自人类，那么可以选择小鼠或兔子的抗体作为一抗。这种不同种属的抗体可以识别并结合到目标蛋白上。

③二抗种属：选择与一抗相应种属的二抗。二抗是与一抗结合的抗体，其可被用于探测和检测一抗。通常情况下，二抗是标记有较容易检测的荧光染料或酶的抗体。   

④物种交叉反应：在选择抗体时要注意潜在的物种交叉反应。一些抗体可能对多个物种的蛋白具有较高的交叉反应性，这可能会导致误解或干扰。确保验证抗体的特异性，并查阅相关文献以了解抗体在特定物种中的应用情况。

⑤每个实验都是独特的，对于不同的目标蛋白和实验条件，可能需要进行不同的选择和优化。因此，在选择抗体种属时，请参考相关文献、抗体供应商的指南，并根据自己的实验需求进行验证和优化。

4.2.4一抗孵育

按抗体说明书比例，分别将一抗和actin抗体用一抗稀释液配好，分别将膜浸泡到配好的抗体中，覆盖摇匀(40r,1h)4°冰箱敷过夜;过夜后将抗体回收，膜用TBST洗三遍(每次5min,80r)

4.2.5二抗孵育

二抗抗体按抗体说明书比例用二抗稀释液配好，将洗好的膜置入盒内，用二抗覆盖摇匀(40r1h)，后将抗体回收，膜用TBST洗三遍(每次5min.80r)

5.曝光

5.1原理

WB 检测中，二抗偶联的最常见的酶是 HRP （辣根过氧化物酶），以 ECL 为底物进行发光检测。

5.2本实验室发光步骤

以ECL Western Blot kit超灵敏化学发光检测试剂盒 (西安壮志科技有限公司) 及化学发光凝胶成像系统 Tanon-5200Multi为例。此步骤仅供参考，具体以自己买的试剂说明书为准。   

①根据膜的大小，按照1:1将A液、B液混匀，配制成发光检测工作液。

②将膜取出，去除膜上多余的液体，放在塑料盒中，用移液器将工作液加到膜上，来回吹吸5-8次，使其均有覆盖。

③化学发光凝胶成像系统：将膜放置到成像仪内，参考仪器说明书进行检测,显影观察结果。

三、常见问题及解决方法

（一）条带弱或无目的条带

（二）多条带或非特异性条带

（三）条带位置异常（表观分子量与理论不符）

（四）高背景

（五）条带变形