RNA分子能够与其他生物分子，如蛋白质、DNA和RNA，发生广泛的相互作用，从而以大分子复合物的形式存在于细胞及生物体中，其中，RNA-蛋白质复合物是RNA存在以及发挥功能的重要形式之一。RNA pull-down是检测与RNA（如 miRNA、lncRNA）相互作用的未知蛋白的重要技术之一。

【技术原理】

首先标记 RNA（如生物素探针标记 RNA），将其与细胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白质复合物，分离复合物得到蛋白质，通过蛋白免疫印迹（western blot）或质谱（massspectrometry）检测蛋白。

【实验方法】

Step1：生物素探针标记RNA的制备

Step2：RNA抽提

Step3：细胞裂解

Step4：磁珠预处理

Step5：RNA与磁珠结合

Step6：RNA 与蛋白相互作用

Step7：蛋白的检测

【实验流程】

【常见问题】

1、RNA结合蛋白没有结合

    可能原因：（1）靶蛋白量不足；（2）缓冲体系不对；（3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低。

    解决方法：（1）增加上样蛋白量；（2）应用低盐体系；（3）加入交联试剂。

2、RNA 降解

    可能原因：无核酸酶的环境被破坏，比如RNA提取过程中的试剂及材料等；体外转录的RNA探针降解等。

     解决方法：清洗和使用新开的离心管和试剂等；RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度。

3、RNA结合蛋白的亲和力不够

    可能原因：结合缓冲环境没有优化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探针用量不足等。

    解决方法：优化孵育时间、温度、盐浓度等条件、增加裂解液和蛋白上样量的比例、适当改变磁珠及探针用量、增加裂解液、确定生物素和链霉亲和素效率等。

4、结合的非特异性高

    可能原因：（1）缓冲环境没有优化；（2）缓冲环境严谨性低；（3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。

    解决方法：（1）优化孵育时间温度盐浓度等条件；（2）使用严谨性高的缓冲体系；（3）调低RNA探针和样品的比例；（4）提高裂解液的量。

5. WB信噪比高

    可能原因：（1）阳性信号率低；（2）一抗效率低；（3）蛋白没有充分溶解。

    解决方法：（1）增加二抗的量；（2）用敏感度的化学发光液；（3）用细胞裂解液预孵一抗；（4）增加样品的量；（5）确定有没有其他可能的结合情况；（6）增加裂解液用量。

【注意事项】

1、RIP反应体系中的试剂和抗体中均需保证无RNase；

2、磁珠与带标签的RNA要充分混合，可优化孵育的温度、时间以及RNA的含量等。