【实验原理】

将细胞小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

【实验步骤】

1. 实验材料准备：

1. 细胞培养相关：处于对数生长期、状态良好且无污染的细胞系；细胞培养基，如含血清的完全培养基用于常规细胞培养、无血清培养基用于实验；胰酶等细胞消化液，用于消化细胞使其从培养容器表面脱离。

2. 试剂：基质胶（如 Matrigel），用于模拟细胞外基质；4% 多聚甲醛固定液，用于固定细胞；结晶紫染液等用于染色；无菌 PBS 缓冲液，用于清洗细胞。

3. 耗材与仪器：Transwell 小室（一种具有通透性膜的小装置，膜上有微孔可供细胞穿过）；细胞培养板；显微镜；枪头、离心管等常规实验耗材；镊子、湿棉签等操作工具。

2. Transwell 小室准备：

1. 基底膜水化（无基质胶的小室可省略此步骤）12：

1. 将 Transwell 小室放入孔板中，每个小室孔中加入适量的无血清培养液，一般为 50 μl。

2. 将孔板放入 37℃的细胞培养箱中温育 30 分钟，使基底膜充分水化，为后续细胞的迁移和侵袭提供适宜的环境。

2. 铺基质胶（模拟细胞外基质环境）：

1. 基质胶需提前在 4℃冰箱中过夜融化，并始终保持在冰上操作，防止其在室温下迅速凝固。

2. 用预冷的枪头吸取适量的基质胶，垂直地加入到 Transwell 小室的上室底部中央，加胶量要适中，避免过多或过少。例如，对于常见的 24 孔 Transwell 小室，加入 60 - 80 μl 的基质胶12。

3. 将加好基质胶的 Transwell 小室放入 37℃的细胞培养箱中，孵育一段时间，让基质胶充分聚合凝固，通常需要 30 - 60 分钟，具体时间可根据基质胶的说明书和实际实验情况确定。

3. 细胞悬液制备2：

1. 提前对细胞进行饥饿处理，将细胞培养在无血清的培养基中 12 - 24 小时，去除细胞周围的血清影响，使细胞处于相对同步的状态，增强实验的重复性。

2. 用胰酶消化细胞，当在显微镜下观察到细胞变圆、从培养容器表面脱离时，加入含血清的培养基终止消化。

3. 将细胞悬液转移到离心管中，进行离心，一般以 800 - 1000 rpm 的转速离心 3 - 5 分钟，去除上清液（即旧的培养液）。

4. 用无菌 PBS 缓冲液洗涤细胞 1 - 2 次，再次离心去除 PBS 缓冲液。

5. 用含有 BSA（牛血清白蛋白）的无血清培养基重新悬浮细胞，调整细胞密度至合适的浓度，一般为 1 - 10×10⁵ 个 /ml，具体密度可根据细胞类型和实验需求进行摸索2。

4. 细胞接种2：

1. 取适量的细胞悬液，加入到 Transwell 小室的上室中，注意要缓慢加入，避免产生气泡。对于 24 孔 Transwell 小室，一般加入 100 - 200 μl 的细胞悬液。

2. 在孔板的下室中加入适量的含有血清（如 10% 胎牛血清）或特定趋化因子的培养基，作为吸引细胞迁移和侵袭的诱导剂。例如，对于 24 孔板的下室，通常加入 600 μl 的培养基。

5. 细胞培养：

1. 将接种好细胞的 Transwell 小室放入细胞培养箱中进行培养，培养时间根据细胞的迁移和侵袭能力而定，通常为 12 - 48 小时2。

2. 在培养过程中，定期观察细胞的状态和小室的情况，如是否有气泡产生等2。

6. 结果统计2：

1. 直接计数法：

1. 细胞固定：小心取出 Transwell 小室，吸去上室内的培养基，用棉签轻轻擦拭基质胶和上室内未穿过膜的细胞。然后，将小室放入含有 4% 多聚甲醛的孔板中进行固定，固定时间为 20 - 30 分钟。

2. 细胞染色：吸去固定液后，将小室移至预先加入结晶紫染液的孔中，让细胞染色 15 - 30 分钟。之后，去除未与细胞结合的结晶紫，可轻轻用棉签擦拭小室的上侧。

3. 细胞计数：用清水冲洗小室，吸干上室内的液体。使用镊子小心地将膜揭下，确保底面朝上并风干。将膜转移到载玻片上，用中性树胶进行封片。在高倍显微镜下观察和拍照，随机选择多个视野（如 5 个或更多），计数呈紫色的阳性细胞，最后统计结果。

2. 间接计数法：如 MTT 法、荧光试剂检测等。以 MTT 法为例，吸去上室内的培养基和未穿过膜的细胞，在孔板中加入含 MTT 的完全培养基，孵育后加入 DMSO 溶解甲臜，最后在酶标仪上测 OD 值，间接反映细胞的数量。

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【常见问题与注意事项】

1. 细胞聚集：

1. 原因：细胞悬液制备过程中操作不当，如吹打不均匀、离心速度或时间不合适等，导致细胞没有充分分散，容易聚集在一起；或者细胞本身的特性使得它们之间存在较强的黏附性。在侵袭实验中，细胞聚集会影响细胞穿过膜的能力，导致实验结果不准确。

2. 解决方法：制备细胞悬液时，要确保吹打均匀，力度适中且避免产生气泡。可以使用适当的细胞筛过滤细胞悬液，去除聚集的细胞团。另外，调整离心的速度和时间，确保细胞能够充分沉淀且不被过度损伤。

2. 基质胶相关问题：

1. 胶液凝固异常：

1. 原因：基质胶对温度非常敏感，在室温下容易迅速凝固。如果在操作过程中，室温过高或者操作时间过长，基质胶可能会在未使用前就过早凝固；相反，如果在铺胶后温度过低，胶液可能凝固不完全，影响实验结果。

2. 解决方法：整个铺胶过程应在冰上操作，提前将所需的枪头、离心管等器具在 4℃预冷。使用前将基质胶在 4℃冰箱中过夜融化，确保其处于液态。在加入基质胶到小室时，要迅速且准确地操作，避免胶液在枪头或小室中凝固。

2. 胶层不均匀或有气泡：

1. 原因：在加入基质胶时，如果速度不均匀或者角度不合适，容易导致胶层不均匀；操作过程中带入的空气或者小室底部不平整，会产生气泡。胶层不均匀会使细胞穿过膜的难度不一致，而气泡会阻碍细胞的迁移，影响实验的准确性。

2. 解决方法：向小室底部中央垂直加入基质胶，保持匀速和稳定的操作，使胶液能够均匀地覆盖在小室底部。加入胶液后，可以将小室轻轻晃动或放置在水平台上观察，如有气泡，可使用枪头小心地将其戳破。

3. 细胞穿过膜的数量异常：

1. 原因：细胞的状态不佳，如细胞活力低、处于非对数生长期、受到污染等，都会影响细胞的侵袭能力，导致穿过膜的细胞数量减少；实验中使用的血清浓度、趋化因子等诱导条件不合适，也可能无法有效地吸引细胞穿过膜；另外，小室的孔径选择不当，对于体积较大的细胞，如果小室孔径过小，会限制细胞的通过，而孔径过大则可能导致非侵袭性的细胞也能轻易穿过，影响实验结果的准确性。

2. 解决方法：确保使用的细胞处于对数生长期且活力良好，在实验前进行细胞活力检测，细胞活力需大于 95%2。根据实验需求和细胞类型，优化血清浓度、趋化因子等诱导条件。选择合适孔径的小室，一般常用的为 8.0 - μm 孔径。

4. 染色和计数问题：

1. 染色不充分或过度染色：

1. 原因：染色液的浓度、染色时间等因素都会影响染色效果。如果染色液浓度过低或染色时间过短，细胞可能染色不充分，导致在显微镜下观察时细胞不清晰，难以准确计数；而染色液浓度过高或染色时间过长，会使细胞过度染色，背景颜色深，也会影响细胞的观察和计数2。

2. 解决方法：根据使用的染色液类型，按照说明书或经验确定合适的染色液浓度和染色时间。在染色过程中，可以定期在显微镜下观察染色效果，以便及时调整染色条件。

2. 计数不准确：

1. 原因：在计数时，如果视野选择不随机或者视野数量过少，会导致计数结果不具有代表性；细胞在膜上的分布不均匀，或者存在细胞重叠的情况，也会影响计数的准确性；此外，如果在擦去上室细胞时操作不当，可能会将下室的细胞也擦掉，导致计数结果偏低。

2. 解决方法：在计数时，应随机选择多个视野，包括上、下、中央、左、右等不同位置的视野，以提高计数的准确性和代表性。对于细胞分布不均匀的情况，可以在计数前轻轻晃动小室，使细胞分布相对均匀。擦去上室细胞时，要使用湿润的棉签轻轻擦拭，避免用力过大擦掉下室的细胞。

侵袭实验注意事项：

1. 实验材料的准备：

1. 细胞培养：确保细胞来源可靠，无污染。在实验前，将细胞培养至对数生长期，以保证细胞具有良好的活力和侵袭能力2。

2. 试剂和耗材：基质胶需保存在 -20℃，使用前在 4℃过夜融化2。其他试剂如无血清培养基、固定液、染色液等，要确保其质量和有效期。Transwell 小室等耗材要选择质量可靠、孔径合适的产品。

2. 实验操作过程：

1. 无菌操作：整个实验过程应在无菌条件下进行，包括细胞的培养、试剂的配制和添加、小室的操作等，以避免细胞污染2。

2. 基底膜水化：在铺胶之前，需要对小室的基底膜进行水化处理，一般加入无血清培养液在 37℃温育一段时间，为细胞的迁移和侵袭提供适宜的环境。

3. 细胞接种：细胞悬液的浓度要准确调整，接种时要将细胞悬液均匀地加入到小室中，避免产生气泡或细胞聚集。同时，要注意控制细胞的接种数量，过多或过少都会影响实验结果。

4. 培养条件：根据细胞的特性和实验需求，选择合适的培养时间和培养条件，如温度、二氧化碳浓度等。培养过程中要避免小室的晃动或移动，以免影响细胞的迁移和侵袭。

3. 数据记录和分析：

1. 实验记录：详细记录实验过程中的各项参数，如细胞类型、细胞数量、基质胶浓度、培养时间等，以便后续分析和重复实验。

2. 数据分析：采用合适的数据分析方法，对细胞穿过膜的数量进行统计和分析。可以使用直接计数法或间接计数法，但要注意操作的准确性和重复性。同时，要对实验结果进行合理的解释和讨论，结合生物学背景和实验目的，判断实验结果的可靠性

【交付标准】

1.  实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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