【实验原理】

　转录因子通常含有两个独立的结构域:DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)，只有当这两种结构域共同作用时才能使转录正常进行。利用此特性，可以分别使BD与AD同“诱饵”蛋白(X)和“猎物”蛋白(Y)形成融合蛋白，一般把用来进行筛选的目的蛋白称为“诱馆”蛋白，而筛到的阳性克隆称为“猎物”蛋白。单独的BD与AD蛋白质游离于细胞中不同的位置而分开，不能激活报告基因的转录。如果两种蛋白X和Y可以发生相互作用，就能使BD与AD在空间上充分接近，从而激活报告基因的转录。

【实验步骤】

一、酵母感受态细胞制备

(1) 将-80℃保存的酵母菌株在YPDA固体培养基平板上划线，30℃培养条件下倒置培养4-7d。

(2) 挑取单菌落至含3mLYPDA液体培养液中。

(3) 30℃培养，200rpm 震荡培养8h。

(4) 当菌液OD值约为0.3时，转移10uL菌液到含50mIYPDA培养液中。

(5) 30℃培养，200rpm震荡培养16-20h至OD值为015-0.3。

(6) 700g转速5min室温离心收集细胞。

(7) 将底部沉淀使用已预热至30℃的100mLYPDA中重悬酵母细胞。

(8) 30℃，200rpm，摇3-5h至OD值=0.6时。

(9) 5min室温离心收集细胞。

(10) 将底部沉淀在30mL无菌超纯水中重悬酵母细胞.

(11) 700g转速5min室温离心收集细胞。

(12) 将底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重悬细胞。

(13) 将悬重悬细胞分成2管，6000g转速室温离心30s。

(15) 将底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重悬酵母细胞，分装为100uL每管。

二、转化

（1）在干净的1.5 mL的离心管中并振荡混匀。

（2）每个离心管中加入100 µL的酵母感受态细胞，500 µL的PEG/LiAc溶液，加入两种质粒，并且将管中的混合物进行旋涡振荡，将其混匀。

（3）在30℃，220 rpm/min的摇床振荡培养30 min。

（4）往每个离心管中加70 µL的DMSO，并温和的上下颠倒混匀。将离心管在42℃水浴中热激40 min（每隔10 min摇匀1次）。

（5）取出离心管，在冰上静置2 min。

（6）吸取100 µL并涂布在相应的二缺固体培养基上，培养3-4天，待菌长好后，挑单菌落于10ulYPDA液体培养基中，30℃培养过夜。

互作验证：

取过夜培养的菌液涂布于四缺平板上，将培养皿置于30℃恒温培养箱中培养，观察是否生长与颜色变化。

【常见问题与注意事项】：

（1）检测感受态细胞效率，标准操作规范。

（2）注意质粒使用量，检查仪器状态。

（3）配制新鲜培养基，并做对照转化，添加抑制剂，同时增设严格的对照组防止自激活。

（4）应挑选大的、新鲜的菌株克隆进行培养。

【交付标准】

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

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