【实验原理】

蛋白质组学是对蛋白质组的研究，研究不同的蛋白质之间如何相互作用以及它们在生物体内发挥的作用。虽然蛋白质的表达可以通过研究mRNA的表达来推断，mRNA是基因和蛋白质之间的中间人，但mRNA的表达水平并不总是与蛋白质的表达水平有很好的相关性[1,3]。此外，对mRNA的研究并不考虑蛋白质的翻译后修饰、裂解、复合物的形成和定位，或可以产生的许多变体mRNA转录本；所有这些都是蛋白质功能的关键。

【实验步骤】

1. 样品准备和处理，提取蛋白质。

2. 蛋白质酶解，将蛋白质切割为肽段。

3. 质谱检测，得到质谱数据。

4. 数据库检索，将质谱数据转化为蛋白质的鉴定和定量信息。

【常见问题与注意事项】

1、蛋白样品不能反复冻融；
2、蛋白样品应加蛋白酶抑制剂，以增加蛋白的稳定性（建议最好能多加几中种蛋白酶抑制剂）；
3、细胞水平要做Western Blot，一般地5×106个细胞提取的蛋白够就足Western Blot；
4、如果目标蛋白是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，建议提取后最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；
5、若转膜不完全，可以加大上样量，还有转移时你可以用降低电流延长时间，转膜液中甲醇的比例多加5－10％；
6、如果上样量超载，可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb；
7、蛋白变性后，－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)；
8、脱脂奶粉中含生物素，如果实验中有涉及到“生物素”请将封闭液改为BSA封闭；
9、做200kd以上蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）；
10、蛋白的上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2；
11、一抗，二抗的比例是比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底；12、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）；
13、抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融；
14、NC膜 PVDF膜 尼龙膜的差异。
尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
15、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的。
PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

【交付标准】

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

联系方式：19379182007，19379182005，19379183390       

公司地址：江西省南昌市南昌县小蓝VR产业基地D座2楼