【实验原理】

应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

【实验步骤】

一.固定、脱水、包埋

00001. 取组织放入4%多聚甲醛里面固定3-4小时,时间根据标本大小适当调整。

00002. 取适当大小组织放入包埋盒中,进行脱水。每个染缸液体体积约200ml,每次脱水可以装20个包埋盒。依次进入:
75%酒精1.5小时、95%酒精1.5小时、95%酒精1小时、无水乙醇1.5小时、无水乙醇1小时、二甲苯一号0.5小时、二甲苯二号0.5小时。
打开包埋机,分别开启冷台,冷点,石蜡槽,组织槽进行工作。然后用铁饭盒承装石蜡块并放入包埋机组织槽中加热溶解。将脱水后的组织连同包埋盒依次放入机器组织槽中,然后再放入石蜡饭盒一号进行第二遍浸蜡,然后石蜡饭盒二号,进行三次浸蜡。

00003. 选大小符合的模具,先调整机器滴蜡的速度,不宜过快防止有气泡。然后在模具中滴入液体石蜡,然后从饭盒二号中拿出浸后的包埋盒,打开用镊子取出组织放入模具中。然后用包埋盒的另一半盖住模具,再滴入少许石蜡后放到冷台上冷却。按上述步骤继续包埋下一个蜡块。

二.切片、制片

00001. 打开切片机,固定蜡块(可提前4度冰箱预冷一下),调整刀片和蜡块的距离。然后调整切片厚度,先粗切,看到完整的蜡片并且有组织后切换厚度,调整到自己想要切的厚度。用力均匀,右手摇动切片,左手用毛笔接片。如片子打卷,可以用毛笔按着蜡片的边缘再缓慢切,这样可以得到相对平整的片子。

00002. 用毛笔和镊子将片子或者带状片子托起,放入水槽中展片,水温在40度左右。然后用防脱片载玻片轻轻捞起,载玻片的边缘尽量不要触碰水槽底部,防止底部气泡上浮残留在片子上。然后标注切片编号放到烤片机上烤片30分钟。

三.组织化学染色

00001. 室温脱蜡、水化:二甲苯一号10分钟、二甲苯二号8分钟、二甲苯三号8分钟、无水乙醇5分钟、90%乙醇3分钟、80%乙醇3分钟、70%乙醇3分钟。蒸馏水3分钟*3次,PBS3分钟*3次。

00002. 热抗原修复,换新的切片架,放入水化后的切片。配置抗原修复液(一包柠檬酸钠粉末配置2升PBS溶液),用铁饭盒或者锅加热煮沸。温度控制在96-98度。然后将切片放入热锅中15分钟,最后自然冷却室温。PBS五分钟*2次,蒸馏水3分钟*2次。

00003. 免疫组化笔画圈:取出组织,甩干水分,可用吸水纸吸干水珠。用组化笔画圈围住组织,圆圈完整。

00004. 灭活内源酶活性:将切片放入湿盒中,盒中加入少量蒸馏水,滴加3%过氧化氢(二抗试剂盒中A一滴或者50微升,剂量详见二抗说明书),室温孵育10分钟。PBS三分钟*3次,蒸馏水水洗三分钟。

00005. 封闭非特异性位点:甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封闭液(二抗试剂盒B一滴或者50微升),放入湿盒内,室温10分钟。

00006. 甩掉封闭液,滴加一抗盖住组织,然后放入湿盒内4摄氏度过夜。(一抗浓度见抗体说明书,提前稀释后分装,并在负二十度冰箱保存。每张片子一抗剂量不定,看组织面积大小,xxxxx癌组织一张20微升左右。

00007. 第二天,4度冰箱取出湿盒,室温复温30分钟,PBS三分钟*三次,蒸馏水洗涤三分钟。

00008. 甩干水分,吸干水珠,滴加二抗(二抗试剂盒C)一滴或者50微升,室温孵育10分钟。PBS三分钟*三次,蒸馏水水洗三分钟。

00009. 每张片子滴加一滴或者50微升链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(二抗试剂盒D),室温孵育10分钟,PBS三分钟*三次,蒸馏水水洗三分钟。

00010. 每张片子滴加两滴或者100微升DAB溶液,显微镜下观察3-10分钟。染色合适即可终止染色,自来水冲洗。

00011. 苏木素复染,1-2分钟,细胞核变蓝色即可终止,自来水或者PBS冲洗反蓝(可用0.5%氨水反蓝)。

00012. 1%盐酸酒精分化3秒,自来水冲洗三分钟。

00013. 脱水:70%酒精1分钟、80%酒精1分钟、95%酒精2分钟、无水乙醇4分钟、二甲苯一号3分钟、二甲苯二号3分钟。

00014. 凉干片子后滴加适量中性树胶封片,盖上盖玻片,小心气泡。晾干半天即可。
显微镜下拍照。

【常见问题与注意事项】

1、标本固定
固定的目的是为了使蛋白质凝固，减少或终止内源性/外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，保存组织或细胞内的抗原性。现在常用的固定剂有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。有些固定剂对特殊组织有更好的效果，如苦味PLP固定液对于含糖组织保存更好，Helly固定液对于胰岛和垂体效果较好等。

2、脱水、石蜡包埋和制片
脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水，对于一些易脆的组织应减少高浓度酒精里的停留时间，透明的时间也应该控制缩短。对组织浸蜡时，一般选用56℃-58℃熔点石蜡，浸蜡温度最好不超过60℃，防止抗原的损失。包埋时应果断迅速，切片时注意检查刀片是否出现缺口，防止；蜡带出现裂痕。

3、脱蜡和水化
使组织恢复到固定后的正常状态暴露抗原，方便与一抗结合。若脱蜡与水化不完全易出现局灶性反应和浸洗不完全，产生非特异性背景着色。

4、抗原修复
由于组织在甲醛或多聚甲醛在固定中，发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率，常用方法通常使用高压加热修复，使用高压加热修复对修复温度和时间的把握十分重要，温度越高修复时间越短，温度与修复时间呈负相关。修复结束后注意室温冷却，让蛋白自然复性。另外，大家尽量使用过量的抗原修复液，防止高温液体挥发干涸，对切片造成不可逆影响。

5、标本固定
传统的免疫组化法容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须对其进行灭活和封闭。灭活内源性过氧化酶一般用3%过氧化氢灭活10min左右，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织。

6、血清封闭
血清封闭的目的是为了一抗与组织的非特异性结合，造成假阳性，一般会采用BSA、羊血清等封闭这些位点，封闭血清一般是和二抗同一来源的，室温封闭10-30min。

7、一抗和二抗浓度和孵育时间
不同的一抗浓度，孵育时间和温度等对染色结果往往有较大的影响。在4℃下，反应缓慢，背景较浅；而37℃反应较快，时间较短；室温介于两者之间，二抗一般室温孵育30min。

8、DAB显色
检测背景的深浅和特异性染色的深浅基本上都以DAB孵育条件决定。DAB的显色时间并不是固定的，主要方法是使用显微镜控制显色时间，到出现特异性染色较强且出现背景着色较浅时就可以冲洗。如果DAB显色时间过长（超过十分钟）才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长，也可以加入金属离子来增强显色（如硫酸铜、氯化钴、硫酸镍铵等）；如果DAB显色时间过短颜色就很深，这可能是一抗过高，需要下调抗体浓度，如果短时间内过深

9、复染
免疫组化染色后为了衬托出组织形态结构有必要进行复染，常用试剂为Mayer’s苏木染色，一般为2 min左右，DAB在核蛋白着色的时间可以适当缩短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返蓝。

10、封片
在封片阶段我们通常是用中性树胶来进行，封片过程中注意斜靠盖玻片防止气泡的产生从而对结果进行营影响，建议最好在通风橱操作，这样有利于气泡排除干净，不影响后续的镜检。

【交付标准】

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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