【实验原理】

通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并随细胞分裂稳定传递，最后用载体中所含抗性基因进行筛选。

【实验步骤】

第一步：筛选浓度测定，以10~14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度；

第二步：进行细胞接种，转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80% 覆盖；

第三步：进行细胞转染

第四步：利用质粒上含有的抗性选择进行筛选，并鉴定筛选结果。

方法二：应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。慢病毒可以携带外源基因随机整合进基因组。转染得到稳定细胞株的效率高，是建立稳定株的最优方式。

第一步：将人源化的抗体基因转接到慢病毒载体上，

第二步：使用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，不同类型病毒包装时间一般在3-5天。

第三步：用病毒转染目的细胞。包装好的病毒要先测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。

第四步：后期筛选。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。

【常见问题与注意事项】

1、筛选前的准备

筛选前我们需要确定药物筛选的相关浓度。对于不同的细胞来说，对药物的敏感度是各不相同的，需要在细胞能够承受的浓度范围内，否则，很容易造成细胞表达低甚至死亡的情况,

2、筛选过程中的注意事项

司一般在72小时;筛选时间:一般在转染后48小时后进行，而对于慢病毒来说加药时

包的变化情况;空白对照:在加药筛选时，需要提前设置好空白对照，全程对比细

换液操作:当细胞死亡达到一定的程度后，需要及时换液，以避避免,害物质造成细胞的死亡,3、克隆筛选过程中的注意事项

在进行单克隆筛选的时候，如果有荧光标记，则尽量选择那些带有光较强的细胞;如果质粒不带荧光标记，则只能进行盲挑。当然了，无论是否带有荧光标记，都需要对其进行验证，而且尽量多挑几个来进行克隆，以保证成功率。

【交付标准】

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

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