【实验原理】

宏基因组技术的核心原理是通过直接从环境样品中提取微生物的DNA或RNA，而不是通过培养分离的方式来研究微生物群落的遗传信息。其主要的实验过程包括:样品采集、DNA/RNA提取、建立文库、高通量测序等。

【实验步骤】

样品制备：样品制备一般由两步组成，分别为样品收集和DNA提取，这一步骤需要极力避免污染，尽量确保使用的所有试剂的“无菌”状态。由于二代测序的高敏感性，在DNA文库中即便极低的DNA含量也会被扩增并测序，一旦引入污染菌群，就会对样品中真实的信号产生覆盖。

文库构建&上机测序：可以看我之前的[二代测序]和[三代测序]系列文章，根据测序平台的选择采用不同的建库方案及上机测序流程。

数据分析：宏基因组流行的分析方法主要分为两种，分别为：测序序列分类（read classification）和宏基因组组装（metagenomic assembly）。前者为宏基因组测序结果与数据库中已知微生物基因组的比对，按照比对结果对reads进行分类，并根据各微生物reads的相对丰度分析样本中各微生物的相对种群丰度；后者为根据宏基因组测序结果，对微生物基因组数据组装为完整的基因组序列。

【常见问题与注意事项】

1.宏基因组测序总DNA的提取有哪些注意事项 ?

获得高质量的环境样品总DNA是宏基因组测序能否成功的关键。为了提取的DNA能够代表特定环境样品中的微生物种类，取样时必须严格遵循采样标准，尽量避免对样品的干扰，缩短保存和运输的时间，以尽可能地保持样品的微生物原貌。若要对功能基因簇进行研究，在提取DNA时，既要尽量完全地抽提出样品中的DNA，又要使获得的DNA保持较大的片段，因此在DNA 提取时要在最大提取量和最小剪切力之间进行折中。

2. 采用llumina高通量测序平台进行宏基因组测序，应如何构建文库 ?从环境样品中提取总DNA后，进行测序文库制备，具体步骤如下:①用物理方法将DNA随机打断成200~500bp的片段;②对DNA末端进行平滑化及修复处理;③ 3'末端加“A”碱基;④ DNA两端加上“Y”型接头;⑤ PCR扩增使两端连上不同的接头序列;⑥检测文库质量。

3. 在宏基因组学研究中，功能基因簇研究的技术路线是什么?功能基因簇的研究方法是通过构建宏基因组文库(BAC、Fosmid、Cosmid)，用表型功能的方法筛选阳性克隆并进行测序。具体技术路线如下

4. 如何进行pathway分析?

5. 常用的pathway数据库包括KEGG、Reactome、BioCyc、RegulonDB、WikiPathwans等。其中，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)共包含19个子数据库，能对基因功能、基因组信息进行系统分析，并将基因和表达作为一个整体网络进行研究。其子数据库GENES中包含完整或部分的测序基因组序列;Pathway数据库中包含基因功能信息，如膜转运信号传递、代谢、细胞周期等。KEGG的另一个数据库LIGAND中则储存了大量的化学信息，包括化学物质、酶、催化反应等。另外，KEGG还提供了出色的整合代谢途径查询，结果中不仅包含了所有的可能代谢途径，而且还对参与各步反应的酶进行了全面的注释，如氨基酸序列、PDB链接等。

【交付标准】

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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