【实验原理】

IP是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等固相支持物上的特异性抗体对抗原进行亲和纯化的方法。基本原理是抗原-抗体特异性结合，检测目的是富集分离蛋白。

Co-IP是IP的延伸，主要是用于探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。基本原理也是抗原-抗体特异性结合，检测目的是蛋白间相互作用。

【实验步骤】

1、样品裂解-裂解液；

2、样品的预纯化-normal IgG/微珠；

3、与目标蛋白抗体共孵育-IP抗体、Normal IgG；

4、免疫共沉淀-微珠；

5、微珠清洗-裂解液；

6、洗脱；

7、WB 分析或其他分析-WB一抗、二抗。

【常见问题与注意事项】

1、高背景

A.可能原因：制备样品中可能有不完全溶解的大的蛋白复合体。

对应解决：制备样品后进行短暂超声处理（3次，每次5秒钟），离心纯化，取上清进行后续实验。

B.可能原因：洗涤不彻底。

对应解决：多次洗涤，并逐渐增加洗涤缓冲液中的NaCl和去垢剂浓度。

C.可能原因：非特异性蛋白吸附于磁珠上。

对应解决：进行预处理以防止非特异性吸附。

D.可能原因：抗体本身特异性不好。

对应解决：选择合适的抗体，可以考虑单抗。

E.可能原因：使用了太多的抗体。

对应解决：进行条件优化减少抗体。

F.可能原因：使用了过多的细胞或组织用于裂解。

对应解决：减少细胞或组织量，推荐使用100-500 μg细胞裂解物。

G.可能原因：抗原降解。

对应解决：保证样品中加入了蛋白酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品。

2、无信号

A.可能原因：目的蛋白在样本中表达量低或者不表达。

对应解决：首先对目的蛋白表达量进行检测，或者加大IP中加入的蛋白裂解物并进行预处理。

B.可能原因：细胞裂解液使用不当。

对应解决：根据实验需要选择，慎重考虑。

C.可能原因：目的蛋白未被洗脱。

对应解决：保证使用合适的洗脱液，保证洗脱液的强度和PH值合适。

D.可能原因：抗原降解。

对应解决：保证样品中加入了蛋白酶抑制剂，尽量使用新鲜制备的样品。

E.可能原因：抗体没有很好的与微珠相互结合。

对应解决：选择合适的微珠。

F.可能原因：抗体选择不当或者不工作。

对应解决：利用WB对抗体进行验证。

G.可能原因：抗体使用不足。

对应解决：查阅文献或者说明书，并多次优化或选择合适的抗体使用量。

3、假阳性

假设Co-IP实验的实验组为“磁珠+抗X抗体+靶蛋白X+目的蛋白Y”，则可能出现的“假阳性”及对应需要设置的实验对照如下所示：

4、免疫共沉淀实验失败原因

A.可能原因：样品被蛋白酶降解。

对应解决：添加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)；所有操作保持 4℃以下冰上操作并防止冻融。

B.可能原因：抗体浓度太低。

对应解决：调整 IP 和/或 IB 抗体浓度， 必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度。

C.可能原因：抗体亲合力太低。

对应解决：选用适合于 IP 和/或 IB 的相应抗体。

D.可能原因：IP 抗体未与珠子结合。

对应解决：选用适合于 IP 的相应珠子， 正确保存防止变质或干燥。

E.可能原因：Tag未暴露在融合蛋白构象的表面。

对应解决：改变 tag 融合表达部位。

F.可能原因：裂解液严谨度太高。

对应解决：改用低严谨度裂解液。

【交付标准】

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

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