【实验原理】

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

【实验步骤】

一、蛋白样本提取制备

1 细胞或组织裂解
2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂
3 蛋白定量
4 电泳上样样品的准备

二、 电泳

1 PAGE 胶的制备
2 蛋白分子量 Marker
3 阳性对照
4 内参对照
5 上样与电泳

三、 转膜与显色（ Western Blot）

1 胶中蛋白的检测
2 蛋白转膜
3 膜上蛋白的检测：丽春红
4 膜的封闭
5 一抗的孵育
6 二抗的孵育
7 显色

【常见问题与注意事项】
一、蛋白样本提取制备蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，是决定 WB 成败的关键步骤之一。

蛋白提取总体原则与注意事项包括：

1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）。

2) 保证蛋白处于可以溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、 表面活性剂、还原剂等的选择实现）。

3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等（全程保证在冰盒中低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。

4) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）。

5) 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

6)条带不清晰：可能是由于抗体质量不佳、孵育条件不当或显色反应不足等原因造成。可以尝试更换抗体、调整孵育条件或延长显色时间来解决。

7) 背景过深：可能是由于抗体浓度过高、孵育时间过长或显色过度等原因导致。可以适当降低抗体浓度、缩短孵育时间或减少显色反应时间以改善背景。

8) 非特异性结合：可能是由于样品中存在杂质或抗体特异性不足引起。可以通过优化样品处理、选择特异性更强的抗体或增加洗涤次数来减少非特异性结合。

 总之，在进行WB实验时，需要注意实验前的准备、样品处理与电泳、转膜与抗体孵育、显色与结果分析以及实验后的处理等方面。通过遵循标准操作程序、注意细节和常见问题解决方案，可以确保实验结果的准确性和可靠性。同时，保持实验记录的完整性和可追溯性对于后续分析和实验总结也至关重要。

【交付标准】

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

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