一、实验目的

(1)了解细菌生理生化反应原理，掌握常用的细菌鉴定生理生化反应试验方法。

(2)了解细菌碳、氮代谢类型的多样性及细菌在不同培养基中的代谢产物在鉴别细菌中的意义。

(3)了解细菌糖发酵实验、IMViC实验的原理及在肠道菌鉴定中的重要作用。

二、实验原理

微生物个体微小、结构简单，但种类繁多，在食品、医药、工农业、环保等人类生产生活的领域均有广泛涉及，涵盖了有益与有害的众多种类。

分类是认识、研究客观事物的一种基本方法，我们要认识、研究和利用种群庞大的微生物资源也必须对其进行分类。根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个类群的特征进行描述以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定。

对一种未知微生物进行分类鉴定，要在获得该微生物的纯培养之后，进行一系列必要的鉴定指标的测定，然后对照权威的鉴定手册进行查对分析。微生物分类鉴定指标可从细胞形态和习性、细胞组分、蛋白质水平、核酸水平这四种水平层次上展开，分类依据包括形态特征、生理生化特征、生态习性、血清学反应、菌反应、细胞壁成分、红外吸收光谱、GC含量、DNA杂合率、核糖体核糖核酸(rRNA)相关度、rRNA的碱基顺序等。微生物的分类鉴定方法分为传统的分类鉴定法以及现代分类鉴定法。传统的微生物分类鉴定法以表型特征为主，以易于观察、具有相对稳定性的微生物的形态学特征、生理生化特征及生态学特征为依据。现代微生物分类鉴定法，借助了现代化分析检测技术手段，将表型特征与分子特征相结合，以细胞组分和含量、蛋白质、核酸等生物大分子特征作为分类鉴定的依据，鉴定结果更为准确可信。

本试验以糖类发酵试验、部分蛋白质、氨基酸及大分子物质代谢试验、有机酸盐及氮盐利用试验为例进行微生物生理生化反应特征的分类检测。各种细菌所具有的酶系统不尽相同、对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供细菌分类鉴别之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物以鉴别细菌的种属，称为细菌的生理生化反应。

1.糖发酵试验

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但因细菌所含的酶系不同，所以它们在分解糖类物质的能力上有很大差异，其发酵糖以后的代谢产物亦不相同。可产酸产气，或产酸不产气。

糖发酵试验在肠道细菌的鉴定上尤为重要。不同肠道菌分解糖类的能力和代谢产物不同。乳糖发酵试验可初步鉴别肠道致病菌和肠道条件致病菌。肠道致病菌多数不发酵乳糖肠道条件致病菌多数发酵乳糖。例如临床上对疑似有大肠杆菌或者伤寒沙门菌等细菌感染患者的样本进行糖发酵试验检测，结果可见大肠杆菌能进行乳糖发酵、产酸产气，而伤寒沙门菌则不能发酵乳糖;进行葡萄糖试验检测，大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2,和H2,，结果为产酸并产气;而伤寒沙门菌缺乏甲酸脱氢酶，发酵葡萄糖后则只产酸不产气。

糖发酵试验细菌代谢产物中酸的产生可利用培养基中溴甲酚紫的颜色变化进行判断，澳甲酚紫指示剂变色范围为pH5.2(黄色)~pH6.8(紫色)。当发酵产酸时，可使培养基颜色由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管内倒置的杜氏小管中有无气泡来判断。

2.吲哚试验

IMViC试验是吲哚(I)试验、甲基红(M)试验、伏-普(V)试验、柠檬酸盐利用(C)试验合称的缩写，常用于鉴定肠道杆菌，特别是用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌。多用于水的细菌学检验，尤其对形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细菌的检验尤为重要。

吲哚试验用于检测细菌是否具有分解色氨酸产生吲哚(靛基质)的能力。有些细菌如大肠杆菌能产生色氨酸水解酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，生成玫瑰吲哚(红色化合物)为阳性反应，而产气杆菌为阴性反应。

3.甲基红试验(M.R或M试验)

甲基红试验用于检测细菌能否分解葡萄糖产生有机酸的能力。很多细菌（如大肠杆菌）分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等有机酸，此时若加入甲基红指示剂，则会使发生颜色变化。甲基红指示剂变色范围pH4.4(红色)~pH6.2(黄色)。当培养基pH降低到4.4以下时，培养基变为红色，此为甲基红试验阳性。有些细如产气杆菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇丙酮酸等，使pH升至6左右，此时加人甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。

4.VP试验(Voges-Proskauer 试验，伏-普试验)

伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。细菌如产气杆菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中蛋白胨精氨酸的胍基反应，生成红色化合物，此为VP反应阳性。大肠杆菌不产生红色化合物，为阴性反应。若在培养基中加入a-萘酚或少量肌酸(0.3%)、肌酐等含胍基的化合物，可加速此反应。本试验常与甲基红试验一起使用，因为甲基红试验呈阳性的细菌，VP试验通常为阴性。

5.柠檬酸盐试验

柠檬酸盐试验用于检测肠杆菌科各属细菌能否利用柠檬酸的能力。有的细菌如产气杆菌，能够利用铵盐作为唯一氮源，利用柠檬酸盐作为唯一碳源，则能在柠檬酸盐培养基上生长。细菌分解利用柠檬酸盐产生CO2,，CO2,与培养基中的Na+、H2O结合形成碳酸钠，碳酸钠与细菌利用铵盐产生的氨反应，形成NH4OH，从而使培养基呈现碱性，使变色范围为pH6.0(黄色)~pH7.6(蓝色)的溴香草酚蓝指示剂由绿色转为深蓝色，此为柠酸盐反应阳性。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌如大肠杆菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。

6.硫化氢试验

某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，产生硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成硫化铅或硫化铁黑色沉淀，为硫化氢试验阳性，黑色沉淀物愈多，表示生成的疏化氢量亦愈多。硫化氢试验培养基中含有硫代硫酸钠，作为一种还原剂，能保持培养基中生成的硫化氢不再被氧化。

硫化氢试验主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属的细菌，绝大多数呈硫化氢试验阳性，其他菌属多为阴性沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。如产气杆菌、变形杆菌硫化氢试验阳性，大肠杆菌硫化氢试验阴性。

7.明胶液化试验

明胶是胶原水解产物，是生物来源的多肽，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25℃以上时明胶就会液化。某些细菌可产生一种胞外酶--明胶酶。明胶酶能分解明胶生成氨基酸，从而使明胶失去凝固力，半固体明胶培养基成为流动的液体培养基。有的甚至在4℃仍能保持液化状态。明胶液化试验可用于肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等能液化明胶，多数假单胞菌也能液化明胶。

8.淀粉水解试验

细菌不能直接利用大分子的淀粉，须将淀粉水解为小分子物质后才可吸收利用。某些细菌可产生胞外淀粉酶，将淀粉水解后产生糊精或进一步水解为双糖或单糖后使其运输到体内。细菌产生淀粉酶水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即加碘液测定时不再产生蓝色。

9.硝酸盐还原试验

硝酸盐还原(nitratereduetion)是生物体内的一种氧化还原反应，即硝酸盐在硝酸还原酶的作用下，还原成亚硝酸的反应。一般指有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。格里斯试剂可用于特征性检验亚硝酸根:产生的亚硝酸盐与Z酸反成生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氨基苯磺酸:生成的重氨基苯磺酸与α-萘胺结合生成N-α萘胺偶苯磺酸(红色化合物)，表明细菌能还原硝酸盐产生亚硝酸盐，此为硝酸盐还原试验阳性。格里斯试剂A液为对氨基苯磺酸加乙酸，格里斯试剂B液为α-萘胺。

硝酸盐还原试验广泛用于细菌鉴定，肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐。硝酸盐还原过程可因细菌不同而异。有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠杆菌等:有的细菌则可使硝酸盐还原为亚硝酸盐和离子态的铵:有的细菌还可以将其还原产物在合成性代谢中完全利用。硝酸盐还原试验要排除干扰，由于亚硝酸盐在自然界广泛分布，容易污染试剂，因此只有对照管阴性时，才能根据试验结果进行判断。硝酸盐的存在可用二苯胺试剂检验。在酸性条件下，二苯胺经硝酸氧化后呈氧化态的颜色即深蓝色或紫色(图1)。

图1

三、实验器材与试剂

1.实验仪器

恒温培养箱、试管、无菌培养皿、杜氏小管、接种环、酒精灯。

2.微生物材料

大肠杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌、产气杆菌斜面

3.培养基

(1)葡萄糖发酵培养基(葡萄糖发酵试验):每组3支试管，每支试管分装培养基5~10mL，试管上标明培养基名称。灭菌后其中1支试管作为阴性对照，另外2支用于接种细菌。

(2)乳糖发酵培养基(乳糖发酵试验):每组3支试管，每支试管分装培养基5~10mL，试管上标明培养基名称。灭菌后其中1支试管作为阴性对照，另外2支用于接种细菌。

(3)胰蛋白水培养基(吲哚试验):每组3支试管，每支试管分装培养基5~10mL，试管上标明培养基名称。灭菌后其中1支试管作为阴性对照，另外2支用于接种细菌。

(4)葡萄糖蛋白陈水培养基(甲基红试验和VP试验):每组6支试管，每支试管分装培养基5~10mL，试管上标明培养基名称。灭菌后其中2支试管分别作为甲基红试验和VF试验的阴性对照，另外4支用于接种细菌，甲基红试验和VP试验各2支。

(5)柠檬酸钠固体培养基(柠檬酸盐利用试验):每组3支试管，5~10mL/管，培养基配制好分装于试管后灭菌，灭菌完成摆成斜面备用。试管上标明培养基名称，其中1支试管作为阴性对照，另外2支用于接种细菌。

(6)柠檬酸铁铵半固体培养基(硫化氢试验):每组3支试管，每支试管分装培养基10mL，试管上标明培养基名称。灭菌后其中1支试管作为阴性对照，另外2支用于接种细菌

(7)明胶培养基(明胶液化试验):每组3支试管，每支试管分装培养基10mL，试管上标明培养基名称。灭菌后其中1支试管作为阴性对照，另外2支用于接种细菌。

(8)淀粉固体培养基(淀粉水解试验):每组60mL，灭菌后倒于3个平板，15~20mL/皿，平板上标明培养基名称。灭菌后其中1个平板试管作为阴性对照，另外2个平板用于接种细菌。

(9)硝酸盐培养基(硝酸盐还原试验):每组3支试管，每支试管分装培养基10mL试管上标明培养基名称。灭菌后其中1支试管作为阴性对照，另外2支用于接种细菌。

4.实验用具

试管、杜氏小管、接种针、接种环、酒精灯、火柴、试管架、记号笔。

5.实验试剂

甲基红试剂、VP试剂、吲哚试剂、格里斯试剂(A、B)、卢戈氏碘液。

四、实验内容与方法

1.葡萄糖发酵试验

(1)接种:取3支葡萄糖发酵培养基试管，其中1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，留下1支不接种作为阴性对照管。试管上标明所接种的菌名和组号。

(2)培养:将已接种好的试管置37℃培养箱中培养24h。

(3)结果观察:

产酸产气:细菌能发酵葡萄糖产生有机酸，使培养基pH降低，培养基中指示剂呈酸性反应，呈现黄色:倒置的杜氏小管中产生气体(气体占杜氏小管的10%以上)。

产酸不产气:细菌能发酵葡萄糖产生有机酸但不产生气体，培养基颜色变为黄色，杜氏小管中无气泡产生。

不产酸不产气:若被测细菌不分解培养基中的葡萄糖，则培养基颜色仍为紫色，不发生变化，且杜氏小管中无气泡产生。

2.乳糖发酵试验

(1)接种:取3支乳糖发酵培养基试管，其中1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，留下1支不接种作为阴性对照管。试管上标明所接种的菌名和组号。

(2)培养:将已接种好的试管置37℃培养箱中培养24h。

(3)结果观察:

产酸产气:细菌能发酵乳糖产生有机酸，使培养基pH降低，培养基中指示剂呈酸性反应，呈现黄色;倒置的杜氏小管中产生气体(气体占杜氏小管的10%以上)

产酸不产气:细菌能发酵乳糖产生有机酸但不产生气体，培养基颜色变为黄色，杜氏小管中无气泡产生。

不产酸不产气:若被测细菌不分解培养基中的乳糖，则培养基颜色仍为紫色，不发生变化，且杜氏小管中无气泡产生。

3.吲哚试验

(1)接种:取3支胰蛋白胨水培养基试管，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支不接种留作阴性对照。试管上标明所接种的菌名和组号。

(2)培养:37 ℃培养 24~48h。

(3)结果观察:沿试管壁缓慢滴加几滴吲哚试剂，注意不要摇动试管，使试剂浮于培养液上层。两液交界面处呈现玫瑰红色为阳性，不变色为阴性。

4.甲基红试验

(1)接种:取3支葡萄糖蛋白胨水培养基试管。1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支不接种留作阴性对照。试管上标注所接种的菌名和组号。

(2)培养:37℃恒温培养48h。

(3)观察结果:加入甲基红指示剂数滴。培养液呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。

5.VP 试验

(1)接种:取3支葡萄糖蛋白胨水培养基试管，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌，1支不接种作为阴性对照。

(2)培养:37℃培养48h取出。

(3)观察结果:培养结束后，往试管培养液中加人5~10滴40%KOH，然后再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振荡试管，再放人37℃培养箱中保温15~30min 加快反应速度若培养液呈现红色，则为VP试验阳性。

6.柠檬酸盐利用试验

(1)接种:取3支柠檬酸盐斜面培养基试管，1支接种大肠杆菌，1支接种产气杆菌1支不接种作为阴性作对照。

(2)培养:37 ℃培养24 h。

(3)观察结果:与阴性对照比较，如果斜面上有细菌生长、培养基颜色变为深蓝色为阳性结果;若培养基不变色，继续培养5~7天，培养基仍不变色保持绿色则为阴性。

7.硫化氢试验

(1)接种:取3支柠檬酸铁铵半固体培养基试管，采用管壁穿刺接种法接种(即无菌接种针挑取菌种后沿着试管管壁穿刺接种)，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，1支不接种作为阴性对照。

(2)培养:接种好的试管培养物置于37℃培养24h。

(3)观察结果:试管培养基中若出现黑色沉淀线为阳性。培养基颜色不变为阴性。

8.明胶液化试验

(1)接种:取3支营养明胶培养基试管，用穿刺接种法接种，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌，1支不接种作为阴性对照。

(2)培养:37℃培养48h。

(3)观察结果:观察明胶的液化情况。若室温较高，培养基自行熔化时，可将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30min，然后取出观察结果，不再凝固表明明胶已被细菌液化，此为明胶液化试验阳性。

9.淀粉水解实验

(1)接种:淀粉培养基冷却到50℃左右，无菌操作制成平板。平板冷却后，取3个平板，用无菌接种环在1个平板上划线接种(蛇形划线)枯草杆菌，在另1个平板上划线接种大肠杆菌(蛇形划线)，另1个平板不接种作为阴性对照。

(2)培养:接种后平板置于37 ℃恒温箱培养 24 h。

(3)观察结果:打开培养皿，将卢戈氏碘液逐滴滴加于平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀布满平板。如菌苔周围有透明圈出现，表明细菌产生淀粉酶，淀粉已被水解。相对于菌落直径，透明圈越大，说明该菌水解淀粉能力越强。

10.硝酸盐还原试验

(1)接种:取3支硝酸盐培养基试管，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌，另1支不接种作为阴性对照。

(2)培养与观察:37℃培养18~96h。用无菌吸管吸取培养物2mL加于试管内，加入格里斯试剂A液和B液各1滴，与未接种细菌的阴性对照管相比较，立即或10min内观察结果。若出现粉红色、玫瑰色、橙色或棕色，则表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原试验。

阳性。加入格里斯试剂后未出现红色反应的培养物，用二苯胺试剂检验硝酸盐的存在。倾斜试管，沿管壁慢慢滴入二苯胺试剂1~2滴，如培养液呈现蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在而未被还原，无亚硝酸盐存在，此为硝酸盐还原试验阴性。若加人格里斯试剂后未出现红色变化的培养物，用二苯胺试剂检验仍无颜色反应(无蓝色出现)，表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都被还原成其他物质，该菌具有硝酸盐还原作用，按硝酸盐还原阳性处理。由于繁殖迅速、硝酸盐还原能力强的细菌，培养时间过久可能将亚硝酸盐全部分解成为氨气和氮气，故须每天进行结果检验。

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