前言:

蛋白质是生命的物质基础，是生命活动的主要承担者，也是科研工作中的重要研究对象。其中蛋白质的含量测定是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品、药物、食品质量检测的重要指标，在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是一项非常重要的工作。

2020版中国药典中收录了6种蛋白质含量的测定方法，分别是凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚法（Lowry法）、双缩脲法、2,2'-联喹啉-4,4'-二羧酸法（BCA法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）和紫外-可见分光光度法，另外常用的还有高效液相色谱法（HPLC法）和酶联免疫吸附法（ELISA法）。这些方法基本上都是根据蛋白质的理化性质和生物学活性建立起来的，本文重点是对这几种方法的原理和特点进行比较。 凯氏定氮法：
原理：蛋白质为含氮的有机化合物，当与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化时使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵；然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量算出含氮量，再将含氮量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。除另有规定外，氮转换为蛋白质的换算系数为6.25（蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右，假设测定物质中的氮全来自蛋白质，则蛋白质含量=含氮量/16%=含氮量×6.25）。
优点：（1）该方法为绝对定量，在蛋白标准品赋值时使用，一般不作为常规的检定方法；（2）不需要昂贵的仪器设备。
缺点：操作繁琐，且灵敏度较低，结果受非蛋白氮的影响，目前已很少应用。 
双缩脲法：
原理：本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，在540nm处有最大的光吸收，且在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。优点：本法快速、灵敏度低，测定范围通常可达1～10mg。缺点：此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上肽键的化合物以及分子内有H2N—CH＝NH-CH2-NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性，干扰测定的物质主要有硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和某些氨基酸等。

Lowry法：
原理：本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物（第一步双缩脲反应），此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
    优点：（1）本法灵敏度较高，适合蛋白质的微量测定，测定范围为40～200μg，定量范围为5~100μg/ml；（2）该法所用仪器简单，不同蛋白质间的变异少，是蛋白质量化的可靠方法，目前国内外多数细胞因子类制品的蛋白质含量采用该法测定。
    缺点：（1）对本法产生干扰的物质较多，对双缩脲反应产生干扰的离子，同样容易干扰福林酚反应，且影响更大（如还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用）；（2）该法反应速度慢、耗时较长。BAC法：
原理：本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物（第一步双缩脲反应），此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

优点：（1）本法灵敏度较高，适合蛋白质的微量测定，测定范围为40～200μg，定量范围为5~100μg/ml；（2）该法所用仪器简单，不同蛋白质间的变异少，是蛋白质量化的可靠方法，目前国内外多数细胞因子类制品的蛋白质含量采用该法测定。

缺点：（1）对本法产生干扰的物质较多，对双缩脲反应产生干扰的离子，同样容易干扰福林酚反应，且影响更大（如还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用）；（2）该法反应速度慢、耗时较长。

Bradford法：
原理：本法属于染料结合法，考马斯亮蓝G250是一种甲基取代的三苯基甲烷，每分子包含两个磺酸基团，呈酸性，该磺酸基团能够通过范德华力与蛋白质分子中的碱性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸结合形成稳定的染料-蛋白蓝色复合物，在595nm波长处有最大吸收峰，并且在一定浓度范围内，复合物颜色深浅与蛋白质含量呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。

优点：（1）本法灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，通常可测定1～200μg的蛋白质量；（2）本法测定简便、快速、需要供试品量少，只需加一种试剂，反应10min。

缺点：（1）本法较Lowry法的干扰物质少，但是仍有一些物质干扰此法的测定，如去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等，供试品缓冲液呈强碱性时也会影响显色；（2）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。
紫外-可见分光光度法：
原理：蛋白质分子中的芳香族氨基酸，包括色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸，含有可以吸收紫外光的共轭双键，在280nm波长处有最大吸收峰，且在此波长内吸光度与其浓度成线性关系。通过分光光度计检测目标蛋白280nm处的波长，即可根据Beer-Lambert定律（A=E*C*l；A代表吸光度，E代表消光系数，C代表蛋白质浓度，l代表光径长度，其中消光系数可以根据蛋白质序列估测）换算出目标蛋白的浓度。

优点：（1）本法操作简便快速，具有无与伦比的便捷性和高效性，可以通过Nanodrop等仪器在几秒内直接读出一个样本的蛋白浓度；（2）本法的灵敏度较高，可以达到微克级别，适用于较纯净、成分相对单一的蛋白质检测，一般供试品浓度为0.2～2mg/ml；（3）本法不用额外添加检测试剂，对蛋白质无破坏性，不影响蛋白活性。

缺点：但本法准确度较差，干扰物质多，因为很多化合物在280nm处有吸光值，会对实验结果造成干扰，尤其是核酸存在严重干扰，故要准确测量，必须要有待测蛋白质或其它蛋白的纯品作标准品参考。
HPLC法：
原理：溶于流动相中的样品各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
特点：具有定量准确、灵敏度高、重复性好、自动化程度高等特点，多用于成品的质量控制，且需要同种蛋白质做为标准品。
ELISA法：
原理：特异蛋白含量测定方法，将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于微孔板内，加入待检样品，通过酶标物显色的深浅间接反映被检样品的存在与否或者量的多少。
特点：该法特异性强、灵敏度高、可同时测定多个样品，适用于生产过程中目标蛋白质含量的测定。

通过以上对比我们不难发现，对于蛋白质含量测定，每一种方法都有自身的优势和缺陷，目前依旧没有一个完美的解决方案，针对同一样本采用不同的方法进行检测，检测结果也可能出现偏差。因此不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应的方法学验证，同时应尽可能选用与待测定品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作标准品，这样实验数据才会更可靠。

如有实验技术问题，可咨询我们

电话：19379182007   

网站：http://consurebio.com/

（扫码添加微信）

主营项目

1

动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2

细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3

分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4

蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5

病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6

生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7

多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8

整体课题实验

方案设计、整体实验交付、标书写作、论文润色、协助投稿

END

联系我们

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

联系方式：19379182007      

公司官网：http://consurebio.com/

公司地址：江西省南昌市南昌县小蓝VR产业基地D座2楼