一、细胞

    
1.选择适当的细胞接种浓度.
贴壁细胞:考虑到细胞大小不同，建议根据具体情况适当调整细胞的密度布局。
悬浮细胞:一般在96孔板中，每个孔放置10000个细胞，可通过细胞计数的方式来进行布板。

    采用状态很好的细胞去铺版,传代太多的细胞不宜拿来使用。铺版如果太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会死掉,细胞密度多采用10000个/孔.100ul/孔

2.药物浓度和处理时间的设定.
    不同类型的细胞对药物的敏感性存在差异。若药物浓度未知，可查阅文献，参考他人的研究结果来初步确定一个较大的范围，计算药物的半数抑制浓度（IC50），并根据IC50值来设定药物的使用浓度。

3.培养时间.
如果要培养48h以上,就换液。(48h换液)

4.无菌操作
在进行MTT或CCK8实验时，请务必进行无菌操作，因为一旦污染会严重影响吸光值的准确性。细菌污染也会导致比色反应的光密度值升高，给实验结果带来干扰。

5.设置对照
   在实验过程中，需要设置调零孔、对照孔和加药孔。调零孔中应加入培养基、MTT或CCK-8以及DMSO；对照孔和加药孔均需加入细胞、培养液和MTT或CCK-8。对照孔中需加入溶解药物的介质，通常为DMSO，而加药组则需要添加不同浓度的药物。

6.设置副孔
每个处理组至少设置3个副孔,3-5个都可以.

二、实验步骤

    
（1）需要做的操作包括收集对数期细胞、调节细胞悬液浓度在1万至2万个细胞/毫升之间，取100微升加入96孔板中。同时，对于96孔板的处理，需要在边缘孔中使用无菌PBS或适当的培养基进行填充。在每个孔中，准备3至5个副孔。

（2）悬浮细胞铺好板放37℃,5%CO2培养箱中静置培养1小时,之后即可加药。药物建议现配现用,采用半比稀释法,培养基配药。(长期保存的药物实用说明书规定的溶液配,例如DMSO,一次性使用的采用培养基稀释药物,达到最终使浓度。)

（3）置37℃,5%CO2孵育到药物处理时间。

（4）在每个孔中加入10μL MTT 溶液（5mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4小时。也可以考虑使用CCK-8 替代 MTT，更加方便。

（5）经过4小时处理后，每个孔加入100ul MTT缓冲液，反应至指定时间，以确保结晶物充分溶解。随后，使用酶联免疫检测仪在OD 570nm（经过630nm校准）下测量各孔的吸光值。

三、MMT的配制

    
    我通常建议现配现用MTT，并在过滤后于4℃避光保存。配制好的MTT需要保持无菌，因为MTT对细菌非常敏感。添加到96孔板时可以不避光，或者将操作台上的照明灯关闭。在配制MTT时，我们建议使用PBS溶解，并在60℃水浴中辅以超声处理以帮助溶解。

四、加入MMT

    
  MTT的添加量宁多勿少，10 µl足矣。若某些孔在加入MTT后立即呈现蓝黑色，则说明可能受到污染。在加入MTT之前，建议先在显微镜下观察，查看是否存在孔内的细胞受到了细菌污染。

CKK8使用方法
1、将100ul细胞悬液接种至96孔板中，并置于预热至37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内进行培养。
2、向每个孔中添加10ul的CCK-8试剂。
3、将培养板放入培养箱中培养1-4小时。
4、在450nm波长下测定吸光度，参考波长设定为600nm以上。

OD值的测定
    细胞密度较高时测得的吸光度也会偏高，而细胞密度较低时吸光度则会偏低。此外，吸光度值也与细胞状态相关，细胞状态不佳时吸光度值通常较低。细胞数量较少或培养时间较短时，OD值也会偏低。若各孔之间的差异性明显，可能存在污染现象，如空白孔的OD值异常高，则很可能是受到细菌污染的影响。

    为了确保实验的准确性，通常会为每个浓度设置5-6个复制孔。在最终统计数据时，可以排除一个最高值和一个最低值，或者剔除那些可能出现的异常数值。这些异常数值的出现可能与多种因素有关，如细胞污染情况、细胞死亡情况、培养液蒸发程度、MTT液的准确使用，以及在37℃和5%二氧化碳的培养箱中孵育时间是否恰当（通常为1-4小时）。这些因素之间存在着紧密的关联。

五、注意事项

    
1.建议控制细胞的接种密度，尤其对于悬浮细胞。一般来说，每孔10000个左右的细胞数量是合适的，不要过多。特别是对于肿瘤细胞，更要注意避免过高的接种密度，宁少勿多。这样可以确保实验结果的准确性和可靠性。

2."对于MTT和CCK-8实验来说，它们本身就是相对粗略的实验方法，因此在结果中出现小幅波动或误差属于正常现象。"

3.在进行铺板时，务必确保细胞悬液充分混合，并且如果长时间静置，需要用枪头重复吹打几次来达到混合均匀的效果。如果细胞分布不均匀，会导致每孔中的细胞数量不一致，建议每接几个孔就进行混匀操作。移液枪的操作需要熟练，尽量避免不必要的误差。另外，过多的吹散次数也会影响细胞的活力，因此请尽快完成铺板操作。

4. 在进行吹打操作时，需要注意细胞悬液的总量不宜过多。过多的悬液不仅容易造成污染，同时也会导致细胞团不易被吹散。建议将细胞悬液控制在6-7ml左右为宜。若悬液量过少，容易产生大量气泡，影响实验的进行。

5.吸液时应将吸头放置于悬浮液底部，稍微提起一点，而在吹液入管时则要保持接近液面，以避免产生气泡。

6.每块板加完后记得晃动培养板,使得细胞能分散的均匀些,铺好板之后精置2min,静下观察细胞分布均匀度以及每孔细胞量是否大概一致。

7.免边缘效应指的是在96孔板中，四周一圈的孔通常只用作空白对照，不应该培养细胞，否则这四排数据可能会出现偏高或偏低的情况。在最外侧一圈的孔中，务必添加水、PBS或培养液，只要能够有效防止蒸发即可。

如有实验技术问题，可咨询我们

电话：19379182007   

网站：http://consurebio.com/

（扫码添加微信）

主营项目

1

动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2

细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3

分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4

蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5

病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6

生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7

多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8

整体课题实验

方案设计、整体实验交付、标书写作、论文润色、协助投稿

END

联系我们

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

联系方式：19379182007      

公司官网：http://consurebio.com/

公司地址：江西省南昌市南昌县小蓝VR产业基地D座2楼