在实验室的日常实验中，每一个细节都可能对结果产生重要影响，尤其是在进行实时荧光定量PCR(qPCR)实验时更是如此。繁忙的实验过程中，我们往往容易忽略一些看似微不足道但却至关重要的步骤。因此，不妨让我们一起回顾并重视那些常常被忽略的实验细节，确保实验结果的准确性和可靠性。

01
如何评判RNA质量？评判RNA质量是分子生物学实验中的一个关键步骤，尤其在涉及RNA测序、cDNA合成、qPCR等实验时，RNA的质量直接影响到实验结果的可靠性和准确性。以下是评判RNA质量的主要方法和步骤：

1. 纯度评估

紫外光谱法:
260/280比值: 理想范围为1.8到2.1，表示RNA样本中蛋白质污染较少。
260/230比值: 理想范围为2.0到2.2，表示RNA样本中有机物和盐类污染较少。荧光染料法:
使用如Qubit等荧光染料，特异性结合RNA，以荧光信号强度定量RNA浓度，具有较高的灵敏度和准确性。

2. 完整性评估

琼脂糖凝胶电泳 :
通过电泳分离RNA片段，观察28S和18S rRNA带。28S rRNA带应约为18S rRNA带的两倍强度，如果两者之间的比例失调或出现降解产物条带，说明RNA有降解。毛细管电泳 和Bioanalyzer:
使用Agilent Bioanalyzer或类似设备，可以更精确地评估RNA质量。通过电泳图谱和RNA完整性数值 (RNA Integrity Number, RIN) 评估RNA完整性。RIN值在1到10之间，值越高表示RNA越完整，通常RIN值大于8被认为是高质量的RNA。

3. RNA质量控制 (QC)指标

RNA降解产物分析:通过电泳图谱中小片段RNA的分布情况来判断RNA是否有明显的降解。qPCR分析:通过qPCR分析多个内参基因的表达情况，评估RNA样本的一致性和质量。

4. RNA纯化

柱式纯化法:使用如Trizol试剂或RNA提取试剂盒，通过裂解、分离和纯化步骤，获得高纯度的RNA。酶处理:使用DNase去除RNA样品中的DNA污染，确保RNA的纯度。
02
基因组DNA残留会导致定量结果不准确

基因组DNA（gDNA）残留是分子生物学实验中一个常见的问题，特别是在RNA提取过程中，如果样本中存在未彻底去除的gDNA残留，会对后续的定量PCR（qPCR）或逆转录定量PCR（RT-qPCR）结果产生显著影响。以下详细介绍基因组DNA残留会导致定量结果不准确的原因及其影响。

基因组DNA残留对定量结果的影响：
假阳性结果:在RT-qPCR实验中，目标是定量特定基因的mRNA表达水平。如果样本中含有gDNA残留，gDNA可能包含与目标mRNA相同的序列，这会导致在没有实际mRNA表达的情况下，PCR扩增出特异性产物，从而产生假阳性结果。

定量偏差:gDNA的存在会影响荧光信号的准确性，从而影响定量结果。因为qPCR依赖于荧光信号强度来测定起始模板的数量，gDNA残留可能会导致荧光信号增加，结果表现为目标基因表达水平被高估。

Ct值偏移:在qPCR中，循环阈值（Ct值）是一个关键参数，表示检测到荧光信号的循环次数。gDNA残留会导致Ct值降低，即在更早的循环中检测到信号，这会影响结果的准确性和可靠性。

避免gDNA残留的方法

使用DNase处理样品:在RNA提取过程中加入DNase酶处理步骤，能有效降解样本中的gDNA。常用的DNase如Turbo DNase，可以在RNA提取后的纯化过程中使用。
设计跨内含子引物:在qPCR实验中，设计跨越内含子的引物，这样即使有gDNA残留，因其不含内含子，无法被扩增出来，从而避免了gDNA干扰。
使用特异性引物和探针:设计特异性引物和探针，确保只针对目标mRNA序列，这有助于减少gDNA干扰。
优化RNA提取步骤:在RNA提取过程中，严格按照操作规程进行，确保样本处理的彻底性，减少gDNA残留的可能性。

检测gDNA残留的方法
阴性对照:设置无逆转录酶（no-RT）阴性对照，仅含有RNA样本和qPCR反应成分，但不含逆转录酶。如果在此对照中检测到特异性扩增产物，说明样本中存在gDNA残留。
引物验证:使用设计好的引物，在样本中进行PCR扩增，并使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。如果出现与gDNA相应大小的条带，则表明样本中含有gDNA残留。
gDNA检测试剂盒:一些商业试剂盒专门用于检测样本中的gDNA残留，可以快速且精确地评估样本中的gDNA污染情况。

03
逆转录引物的选择

随机引物: 可以逆转录所有RNA分子，适合未知RNA的初步研究。但可能导致cDNA片段长度不一致。
oligo(dT)引物:仅逆转录mRNA，适合研究多种mRNA转录本。但无法逆转录没有poly-A尾的RNA。
基因特异性引物:只逆转录特定的RNA序列，适合定量特定基因。但可能需要多次逆转录反应来检测多个基因。
选择适合的逆转录引物:根据实验目的选择合适的逆转录引物，确保逆转录效率和特异性，以便后续的qPCR定量准确可靠。

04
qPCR反应体系配制

反应体系的均一性:
使用新鲜配置的qPCR反应体系，避免长时间储存导致反应效率下降。
严格按照反应体系的体积比例配制，确保反应成分的均匀分布。
使用预混合（master mix）试剂盒，减少配制误差。使用无核酸酶的试剂和耗材:
使用RNase/DNase-free的试剂和耗材，避免外源核酸酶污染。反应组分的优化:
优化MgCl2浓度、引物浓度和dNTP浓度，确保最佳扩增效率。

05
反应条件优化

退火温度的优化:
通过梯度PCR确定最佳退火温度，提高反应特异性和效率。扩增效率的检测:
绘制标准曲线，计算扩增效率，确保在90-110%之间。低于或高于此范围的扩增效率会影响定量结果的准确性。使用适当的循环数:
通常40个循环足够检测到低丰度的RNA，避免过多循环导致非特异性扩增。

06
 实验设置与数据分析

实验设置:
设置标准曲线: 使用已知浓度的模板，绘制标准曲线，确保定量结果的准确性。
设置阴性对照: 包含no-template control（NTC）和no-RT对照，检测样品中是否有污染或gDNA残留。
设置阳性对照: 包含已知浓度的阳性模板，验证反应体系和引物的有效性。数据分析:
Ct值的准确判定: 确保Ct值在检测范围内，并剔除异常值。
扩增曲线分析: 确保扩增曲线的形状符合标准S形曲线，避免非特异性扩增。
熔解曲线分析: 检查熔解曲线的单一峰值，验证扩增产物的特异性。

07
仪器校准与维护

仪器校准:
定期校准qPCR仪器，确保温度控制和荧光检测的准确性。
使用校准标准品，验证仪器的性能。仪器维护:
定期清洁和维护qPCR仪器，确保反应孔板、荧光检测系统和光学系统的清洁。
遵循制造商的维护指南，定期更换耗材和检测系统部件。

总结

在qPCR实验中，细节决定成败。选择合适的逆转录引物、严格配制反应体系、优化反应条件、设置合理的实验对照和严格的数据分析，以及定期校准和维护仪器，都是确保qPCR实验结果准确可靠的关键步骤。只有关注这些细节，才能获得高质量的qPCR数据，确保实验的成功。

主营项目

1

动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2

细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3

分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4

蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5

病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6

生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7

多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8

整体课题实验

方案设计、整体实验交付、标书写作、论文润色、协助投稿

END

联系我们

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

联系方式：19379182007      

公司官网：http://consurebio.com/

公司地址：江西省南昌市南昌县小蓝VR产业基地D座2楼