样本制备注意事项

1、根据不同的检测细胞调整合适的温度、湿度、酸碱度等培养环境，注意一定要无菌的环境培养。

2、培养细胞时，以对数期处理为宜，避免细胞量过少导致收集细胞量不足或者细胞量过多导致细胞开始大量死亡造成的实验误差。

3、流式检测细胞周期上机检测所需收集细胞量较多，收集细胞时尽量多收集一些

4、流式检测对细胞离心，重悬次数较多，注意动作轻缓，避免过多地损伤、弄破细胞。

5、本实验对细胞离心，重悬次数较多，注意动作轻缓，避免过多地损伤细胞。

6、细胞周期待测细胞尽量要获得单个细胞，避免DNA的降解。

7、样本最关键的就是减少碎片(EDTA/不可过度吹打/离心rpm)。PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解。PI质量及RNase所加量很重要，建议用商品化试剂。

8、污染脱氧核糖核酸酶会降解DNA，故玻璃器皿和试剂要干净灭菌。

9、染液等物质有一定毒性，注意防护。

流式检测时的注意事项

01

固定时必须预冷PBS重悬打入无水乙醇中，做到随加随混匀，避免细胞形成团块。

02

固定后细胞虽然可以保存较长时间后再上机检测，为避免不可控因素影响最好尽早上机检测。

03

进样速度：一般检测细胞浓度调整为2*10^5到2*10^6/ml，建议进样速度为低速。若峰形较宽、CV较大，可能就是进样速度太快。

04

仪器质控定期做，检查质控微球的CV值，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽。

05

通过电压脉冲信号的宽度、高度、面积等参数区别实体组织标本中的粘连细胞群体，最大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果。

06

选择合适的细胞系，不同的细胞系由于细胞形态、直径等不同，会对结果的美观程度有一定的影响，笔者常用HeLa细胞系，峰形较细，周期各阶段明显区别，结果美观。

07

建议选择6孔板操作，细胞给药密度在40%左右，给药时间不一定要与蛋白印迹法给药时间一致。这是由于蛋白印迹法检测的是蛋白表达的变化，例如给药10小时，蛋白上可见明显变化趋势，但10小时收样时，孔内细胞已经明显观察到细胞漂浮凋亡，那对流式检测的结果会有很大的影响。流式细胞术收样时，尽量保证孔内细胞还未漂浮。

08

收样时，如果孔内已经有细胞漂浮，细胞上清悬浮液也要收集。建议选用胰酶消化，消化时间必须严格控制，及时终止消化，消化时间太久，容易对细胞造成损伤和死亡。

09

收集细胞时，离心机选用4℃，300-500g离心5分钟，小心吸去上清。加入0.3 mL预冷的PBS，将管内的细胞混匀后，再加入0.7 mL预冷的无水乙醇，4℃固定过夜。整个收样过程中，不要用枪头剧烈吹打细胞，一是会损伤细胞，二是造成细胞损失。

10

上机前，离心机选用4℃，300-500g离心5分钟，弃去上清。此时格外需要注意的是由于不同时期细胞的重量不一样，离心后细胞不是全部沉淀在管底，管壁上也会存在大量细胞，去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液，避光染色15分钟以上，上机测试前最好使用200目筛网过筛，以免细胞聚集堵塞机器管道。

细胞周期检测常见问题解答与处理

问

细胞量太少，得不到数据结果白做了咋办?

答

待测的细胞已经制备完了太少不容易挽救，正确的操作方法如下:

1)要保证收集足够的细胞样品(个人经验至少收集100万左右);如果药物处理后细胞死亡过多，应该降低药物浓度;

2)固定细胞时先用预冷的PBS 重悬细胞，再逐滴滴入无水乙醇中;

3)细胞清洗时，不可过度吹打细胞，以防产生过多的细胞碎片;

4)最后，尽量采用尖底的离心管和水平的离心机，离心后尽量用移液枪吸走上清，不要倾倒，残留一点，不要吸完。

问

可不可以用70~75%乙醇直接固定细胞，反正乙醇固定细胞的终浓度也是这么多?

答

不可以，直接用70~75%乙醇加入很容易导致细胞聚团现象，很难重悬成单细胞，影响固定效果，甚至容易导致固定后无细胞沉淀的现象。

正确做法是:待细胞充分分散成单细胞后，缓慢地滴入无水乙醇中，使其终浓度为70~75%乙

醇。

问

在测定细胞周期的时候,由于固定、消化等处理后会出现很多细胞碎片，影响测量结果，无法找到G1期细胞群怎么办?

答

在测定细胞周期的时候，除了设苦好获取数据的模版外，另外设置直方图，测量模式为线性放大，调整放大倍数，使二倍体峰出现在横坐标50道的位置，就很容易的找到了二倍体峰和细胞周期个时相细胞的分布情况。

问

做流式分析细胞周期时，收集了10^6左右的细胞，但是固定后没有细胞沉淀，甚至 PBS 洗涤后上机已经没有细胞了，哪个环节出了问题?

答

确定收集了足量细胞但是没有细胞沉淀且上机没看见待测细胞的话，应该洗涤过程中细胞丢失了。

1)尽量采用尖底的离心管和水平离心机

2)离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒，吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。

3)离心的转速或时间可以适当增加。

4)每次加试剂时，吸头最好不要接触液面，混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。

问

什么样的数据可以用?

答

1)G2/M期细胞的DNA 含量是G1期的2倍，在直方图上形成一个2倍于G1信号峰的高斯峰。

2) CV(变异系数)表示峰的宽度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被认可。

3) RCS 最好是在1~3，高于5则不被认可。RCS高，说明数据的分布和软件所建立模型的预期值的差别比较大，可能由于处理细胞的时候RNA 酶消化不好，或者是PI的浓度不佳造成的。

问

怎样提高实验结果的分辨率和精确度?

答

变异系数(Coefficient of Variation，CV值)反映G0/G1峰分辨率和精确度。而样品 CV值为样品固有，与样本制备过程中细胞质量有关。细胞碎片越少、细胞聚团越少、RNA酶消化越充分，可以减少样本的CV值，提高 G0/G1峰分辨率和精确度。

主营项目

1

动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2

细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3

分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4

蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5

病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6

生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7

多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8

整体课题实验

方案设计、整体实验交付、标书写作、论文润色、协助投稿

END

联系我们

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

联系方式：19379182007      

公司官网：http://consurebio.com/

公司地址：江西省南昌市南昌县小蓝VR产业基地D座2楼