第一步、选定目标Marker以符合实验目的

通过查阅相关文献资料，明确实验所需选取的Marker及其相互间的逻辑关系（如Marker间的层级关系，以T细胞为例，CD3为“父”，CD4或CD8则为“子”）。

以下列出若干典型细胞标记Marker：

第二步、明确Marker的表达部位

针对细胞质或细胞核内的Marker，需对细胞执行固定及破膜/破核膜处理。进行细胞质或细胞核Marker染色时，应先进行细胞表面Marker的染色，随后固定并破膜细胞，最后对细胞内或核内Marker进行染色。在此过程中，细胞表面Marker的染色应尽量避免使用串联染料，因为固定步骤可能会对串联荧光素产生不利影响。

一般而言，多数CD分子标记位于细胞表面；IL系列、IFN-γ、TNF-α等则属于细胞内标记；而核内染色的典型代表是Foxp3。

在确认Marker表达位置的同时，了解其表达量同样重要。流式配色的一大基本原则是“强弱结合”，即依据Marker表达量的强弱来合理搭配荧光素的强弱。

根据目标细胞类型中相应抗原的表达量，我们通常可将抗原分子大致分为三类：

易于鉴定，阴阳性细胞群区分明显，阴阳性峰显著分离的抗原，如CD3、CD4、CD19等。

易于鉴定，表达水平高且常呈连续性分布的抗原，例如CD27、CD28、CD45RA、CD45RO等。

表达水平低，可能为激活性Marker或未知但关键的抗原，如CD25、STAT5、Foxp3等。

Marker的表达量强弱可参考厂家提供的质检数据，但更需结合文献中具体细胞群体的表达情况进行综合判断。

第三步、掌握实验所用流式细胞仪的具体配置，涵盖激光器、检测通道及滤光片等关键部件

如前所述，流式细胞仪能同时检测多种荧光，但这些荧光间可能产生相互干扰。因此，需依据流式细胞仪的通道配置，来确定可选用的荧光素种类，以便在后续搭配时有效规避干扰。若缺乏仪器通道的具体信息，将无法准确选定适用的荧光素，配色工作便如同“无根之木，无源之水”。

在通过仪器通道信息确定了可选荧光素后，还需进一步了解这些荧光素的特性，包括其激发波长、发射波长以及与之匹配的滤光片等信息，确保它们与流式细胞仪的通道设置相匹配。

第四步、掌握荧光素的强度特性

以下表格列出了常见荧光素的强度等级：

在明确了Marker的表达强弱以及流式细胞仪可检测的荧光素强度后，我们应遵循“强弱搭配”的原则来进行配色。对于强表达的抗原，既可选择弱荧光素，也可选用强荧光素。

例如，强表达的抗原CD3，无论选择弱荧光素FITC还是强荧光素APC，对实验结果的影响均不显著。

然而，对于弱表达的抗原，则必须选择强荧光素以确保检测的准确性。

以弱表达的抗原CD25为例，若选择弱荧光素PerCP，可能导致阴阳性细胞群无法有效区分。而若选用强荧光素PE，则能清晰地观察到阳性细胞群。

当然，在配色过程中，我们可能还会遇到其他问题，如细胞样本的自发荧光、细胞处理过程中死细胞的产生（需额外添加死活细胞染料）等。因此，在配色时，我们应特别注意为这些特殊情况预留相应的荧光检测通道，以确保实验的顺利进行。相信在掌握了流式配色的基本原则及操作步骤后，大家的实验将能更加顺利地开展。

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