干货分享 | get这些常规细胞实验，高分文章稳了（下）

前几期带大家了解过一些常规的细胞实验【干货分享 | get这些常规细胞实验，高分文章稳了（上）】，相信对大家课题研究方面还是有一些帮助的，今天再给大家整理一波，一起来看看吧~

细胞迁移和侵袭

在肿瘤发展过程中，细胞进入循环系统的能力是重要的研究对象。相关的信号通路主要可以分为控制细胞黏附和控制细胞骨架。细胞的迁移与侵袭主要与细胞骨架和黏附相关。肿瘤细胞侵袭和迁移能力的改变通常采用Transwell进行检测。细胞划痕也是测定肿瘤细胞运动特性的方法，由于无法区别正常增殖和迁移细胞，应用有局限性。

1.Transwell实验

Transwell小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

肿瘤迁移实验：研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

肿瘤侵袭实验：研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室，计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。　

✓目的：研究目的基因过表达/干扰对细胞侵袭、转移能力的影响

✓材料：正常细胞、对照慢病毒、过表达基因慢病毒

✓步骤：细胞复苏——Transwell铺板——细胞培养及染色——拍照

✓结果：

2. 划痕实验：

划痕实验检测细胞迁移的原理：在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，在显微镜下观察并拍照记录特定位置细胞的生长迁移能力。

实验通常需设定正常对照组和实验组,实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。

细胞周期检测

细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期反应了细胞增殖速度，单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

原理：细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的 G0/G1期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

✓目的：通过慢病毒感染获得基因过表达的细胞株，利用PI染色法结合流式细胞术检测各组细胞周期的变化。从而研究目的基因对细胞周期的影响。

✓材料：目的细胞、病毒

✓步骤：细胞准备——样品收集——上机检测——数据分析

✓结果：

细胞克隆实验

细胞克隆实验原理：单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），其后代所形成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3 - 1.0mm之间。

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数， 但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖并形成克隆。只有同时具有贴壁和增殖活力的细胞才会形成克隆。克隆形成率反映细胞的独立生存能力的强弱，用于评价细胞群体依赖性和增殖能力。

由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在培养皿中，持续一周以上，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

✓目的：通过目的基因过表达/干扰细胞组、空细胞组与阴性对照组(空病毒)克隆形成数量的统计学分析，研究基因对细胞群体依赖性和增殖能力的影响。

✓材料：病毒和细胞株

✓步骤：铺板——细胞培养——观察克隆，染色，计算克隆形成率

✓结果：

细胞粘附实验

细胞粘附实验实验原理：细胞黏附性是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动和发挥功能的调节因素，并且对细胞的增殖、分化有重要影响。通常可分为两类，即细胞与细胞黏附和细胞与基质黏附。

机体内许多细胞，如上皮细胞，需要牢固地定在某处发挥功能；另一些细胞，如白细胞，活跃运动，就需要不断调节细胞黏附。细胞黏附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力，提示这些细胞在相互识别及黏附机制方面发生了改变。

实验方法：

1、将4.5×105个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。

2、培养24h后，用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞（两个平行孔，Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7），转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。 

3、培养48小时后收集细胞，用0.25%胰酶将贴壁培养细胞（约1×106个）从壁上消化下来并制成单细胞悬液。 

4、用无血清MEM培养基将Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜胶备用。

5、96孔板每孔中铺Matrigel 2ug/50ul，放于超净台中风干过夜。 

6、96孔板每孔加入适量无血清MEM细胞培养液(或PBS或生理盐水)，放置60－90分钟，洗去多余的胶； 

7、取转染、阴性对照转染及不行转染的Hep3B细胞以4×103/孔接种在铺胶的96孔板中，设3个重复孔，放入37℃、5％CO2培养箱中分别培养20min、40min、60min。 

8、在相应时间点取出96孔板，吸出培养液，用PBS洗3遍，洗去未粘附细胞。

9、每孔加入100 ul甲醇，固定15min。 

10、每孔加入100 ul姬姆萨染液，染色15min，蒸馏水洗去染液。 

11、在200倍显微镜下计数粘附细胞数量（每孔在固定位置取8个视野）。

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1

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2

细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3

分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4

蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5

病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6

生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7

多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8

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