一、qPCR 实验前期筹备

（一）RNA模板要求

实验启动前，需确保RNA模板的纯度、浓度及完整性均符合标准，方可推进后续步骤。具体要求如下：

①RNA需保持一级结构完好无损。

②高纯度：无DNA、游离核苷酸等核酸杂质；无酶抑制性有机溶剂、金属离子及蛋白质、多糖、脂类等污染物。

③足够浓度：需满足反转录实验的基本需求。

（二）qPCR引物设计规范

引物建议长度介于18~30个碱基；GC含量应控制在40%~60%之间；设计时应跨越内含子，避免内部出现互补序列。通常，引物终浓度设为0.2μM效果较佳；若反应效果不佳，可在0.1~1.0μM范围内适当调整引物浓度。

二、实验规划——内参基因选定

内参基因，又称管家基因，其表达水平恒定，不受内源及外源因素干扰。此类基因高度保守，于各类细胞与组织间稳定表达，且表达量无明显差异。在进行qPCR相对定量时，内参基因不可或缺，常用者如GAPDH、β-actin及18s rRNA等。

内参基因功能概述：

▶ 消除终产物定量误差

▶ 校正样本加载量偏差

▶ 抵消PCR抑制物干扰

▶ 平衡cDNA合成效率差异

内参基因筛选标准：

▶ 不与目的基因扩增相干扰

▶ 表达水平适中，避免过高或过低

▶ 于各类细胞与组织间表达稳定，量无显著差异

▶ 表达与细胞周期及活化状态无关

▶ 完全独立于内源及外源因素，包括实验处理影响

三、实验设计——阳性/阴性对照

在规划qPCR实验时，为确保实验质量，避免模板污染、操作失误等导致的实验失败，必须设置阴性与阳性对照组。

阳性(+)对照组设置：

可选用含PCR扩增子的合成RNA/cDNA寡核苷酸、质粒DNA、克隆重组质粒、体外转录RNA、特定生物样本的RNA/DNA，或国际公认的生物标准品等作为阳性对照。此对照有助于迅速诊断实验失败原因，究竟是试剂失效还是仪器故障。

阴性(-)对照组设置：

四、数据分析——△△Ct法

PCR扩增指数期内，模板Ct值与其起始浓度对数呈线性关联，起始拷贝数愈多，Ct值愈小。通过构建标准曲线，可对未知样本进行精确定量，进而评估基因表达差异或基因拷贝数。通常采用2-△△Ct法，实现目的基因的相对定量测定。

五、数据分析——扩增与融解曲线解析

1、扩增曲线分析

扩增曲线应呈现平滑S型，需确保所有样本起始无扩增信号，且阴性对照（包括无模板对照NTC与无反转录对照NRC）无荧光响应，即无S型扩增曲线，同时扩增起峰时间需符合预期。

2、融解曲线分析

融解曲线应呈现单一峰值，该峰值对应目的产物的特定Tm值，此Tm值与产物种类紧密相关，不受模板量、引物浓度等外部条件影响。理想的单峰应狭窄且尖锐，阴性对照中不应出现显著高峰。

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