流式细胞术 (Flow Cytometry, FCM) 是一种在液流中快速检测细胞特性的技术，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。它通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞进行多参数定量分析，包括细胞表面标记、细胞内蛋白质表达、细胞周期、DNA含量等。流式细胞术具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学等领域。

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流式细胞术原理

一、分析型流式细胞仪检测原理

将待测样品制成单细胞悬液，在鞘液的包裹下进入流式细胞仪内的检测区域，细胞在激光的照射下会发生散射和折射，产生的散射光信号和荧光信号由不同的通道接收。

其中前向角散射光(FSC)的强度与细胞直径成正相关，可以理解为细胞直径越大，FSC越强，细胞直径越小，FSC越弱。侧向角散射光(SSC)的强度与细胞内颗粒结构复杂程度成正相关，可以理解为细胞内颗粒结构越复杂，SSC越强，细胞内颗粒结构越简单，SSC越弱。而荧光信号的强度则与所待测细胞与荧光染料结合程度有关。

最后计算机分析系统会对接收的不同电信号进行分析处理，检测结果最后用单参数峰、双参数散点图、三维立体图等来表示。

二、分选型流式细胞仪检测原理

通过分析检测细胞，判断是否需要将液滴进行分选。在将这些细胞液滴转变成独立液滴之前，对其进行相应处理以赋予特定电荷。这些带电荷的独立液滴在强电场中会发生偏移，然后进入相应的收集管中。未被收集的液滴将被处理为废液，实现流式细胞分选。

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流式细胞仪结构

流式细胞仪包括分析型和分选型两种类型

1、分析型由液流系统、光路检测系统、检测分析系统组成

2、分选型由液流系统、光路检测系统、检测分析系统、分选系统组成

液流系统：由鞘液流和样品流构成,鞘液流从鞘液桶开始,流过专门的管道进入喷嘴,经过喷嘴的小孔形成稳定的可见液流。

检测分析系统：主要是对各个通道收集到的光信号进行汇总分析,通过分析得到样品中所有细胞的理化特征,最后以各种图谱进行结果展示。

光路检测系统：包括激光、透镜和光学信号检测器。激光从激光器发出,照射到样品流中的细胞会产生散射光,如果细胞上结合有荧光素,若可以被激光激发,荧光素则会向四周发射荧光。散射光信号包括正对激光方向接收的前向角散射光(FSC)和与激光方向在同一个水平面并与激光成90°角的侧向角散射光(SSC),荧光信号与SSC接收方向相同。

分选系统：位于液流可见部分,是在喷嘴处多了一个高速振荡器,在分选过程中使用喷嘴高速振荡,带动从喷嘴流出的可见液流高速振荡,从而使可见液流在下段形成相互独立的液滴而不是连续的液流。

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流式细胞术实验步骤

1、样本准备样本可以来源于组织、血液或其他液体，最终均需制备成单细胞悬液，便于染色和检测。

2、细胞染色流式检测需要对细胞进行染色以标记特异性抗原。

染色方法大体分为两类：表面抗原直染、胞内抗原染色。表面抗原直染时，细胞和荧光偶联抗体直接孵育即可；胞内抗原染色时，需进行固定和破膜后再和荧光偶联抗体孵育。

3、细胞洗涤
在染色过程中，需要使用洗涤液对细胞进行洗涤以去除未结合的抗体和其他杂质。洗涤液一般使用预冷PBS，可选择性加入2%BSA或2%FBS以提高细胞处理中的存活率。通过洗涤可以减少非特异性结合和背景干扰，提高实验的特异性和准确性。   

4、细胞固定

对于胞内抗原检测，可以使用固定液（如4%多聚甲醛）和破膜剂（如0.1% Triton X-100）对细胞进行固定和打孔。固定液可以减少细胞的活性和变形，保持细胞的形态和抗原位置的稳定性。破膜剂有利于抗体进入与待测抗原结合。

在采集期间，细胞会通过激光器激发标记物产生荧光，而这些信号会被检测器捕获。收集的数据通常以FCS(Flow Cytometry Standard) 文件的形式保存。通过这些数据可以了解每个细胞的特性及其分布情况。

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流式细胞术特点

1、速度快：通过对单个细胞或生物颗粒进行逐个检测，测量速度可达每秒数千甚至上万个细胞。

2、灵敏度高

3、多参数

4、精度高

5、纯度高

6、无害性

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流式检测中常用的免疫细胞及常用标志物

免疫细胞标记物被广泛用于流式检测中鉴别和区分不同类型的免疫细胞

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流式细胞术应用

1、细胞表型分析：细胞用带有荧光的单克隆抗体标记后，用流式细胞仪可对其进行检测分析，分析荧光细胞含量,也可分析阳性细胞CD分子的相对含量。

2、血小板功能分析与血小板病诊断：通过用荧光素标记的单克隆抗体结合流式细胞术，可以敏感、特异、快速的诊断血小板病。

3、红细胞疾病诊断

4、细胞内蛋白分析：细胞破膜后将细胞内某一蛋白成分进行荧光标记，用流式细胞仪进行测量分析，测出阳性细胞数量和这种蛋白的相对含量。

5、分选：用荧光探针标记的细胞，可被有效分离出来。通过标记Ki67、BCL-2、caspases等增殖及凋亡相关基因，流式细胞术可用来检测细胞的增殖以及凋亡。

6、流式细胞术可用来分析细胞周期

7、在肿瘤学研究中尤其常用。流式细胞术可以用于判断药物对肿瘤细胞影响、肿瘤的生长速度等。

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