Western Blot虽是实验室最常用的蛋白分析技术，但是由于它步骤繁琐、操作流程长、影响因素多，所以，导致我们在做实验时会遇到各式各样的问题。今天我们总结了一些WB实验中经常遇到的各种“奇葩”条带问题，并为你推荐了常用的解决方法，希望对大家有所帮助。

一、目标条带没有信号

原因分析：    

样品中可能含有蛋白酶，使蛋白样品分解成小分子。

解决方法： 添加蛋白酶抑制剂。

原因分析：    

目标蛋白浓度过低（低于检测下线）。

力

 解决方法：

加大上样量或提高目标蛋白浓度。
 原因分析：

转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上，或者转膜时间过长导致样品转穿。

解决方法：

 控制转膜时间并选择适合的转印膜。
原因分析：

 一抗的特异性不佳，导致一抗无法识别目标蛋白。

解决方法：

 选用高品质抗体。
  原因分析：

一抗反复使用后导致效价降低，尽管还能与目标蛋白连接，但连接蛋白的数量太    一抗不宜反复使用。

 洗脱过渡导致与一抗相结合的目标蛋白被洗掉。 

  解决方法：

 洗脱时间的时间和频率应有效控制，一般建议3次10分钟。

二. 图片背景过高，难以分辨条带

原因分析及 解决方法    

一抗浓度太高，导致抗体非特异性结合。    降低一抗浓度。
   

洗膜的时间和次数不够，导致其他蛋白没有清洗干净

   提高洗脱时间和频率。
   

封闭物用量不足。

   提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜。
   

封闭物使用不当。    检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。
   

封闭时间不够。    室温37度封闭1小时以上，4度封闭过夜。
   

一抗稀释度不适宜。    对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
   

一抗孵育的温度偏高。    建议4℃结合过夜。
   

三、 膜上出现黑点和黑斑

原因分析及解决方法
   

膜上其他部位与一 抗或二抗非特异性结合，配置的封闭液可能没有完全溶解，使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点。

 配置封闭液后最好静止一下，封闭牛奶一定要纯，封闭结束之前要清洗三遍之后再加一抗。
    

抗体与封闭试剂反应。    

使用前过滤封闭试剂。
   

HRP偶联二 抗中有聚集体。  

  过滤二抗试剂，去除聚集体。
   

四、出现非特异性条带

原因分析    解决问题    

一抗非特异性与蛋白结合，此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。   

 更换一抗。    

目的蛋白有多个修饰位点，有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。 

 更换一抗品种。
   

蛋白样品降解，蛋白酶将目标蛋白分解成若千个蛋白，而这些蛋白同样可以被一抗识别。  

 添加蛋白酶抑制剂。

五、条带中出现整条白色空斑

原因分析    解决问题    

过高的蛋白上样量或一抗和二抗浓度过高都会促使底物过快的消耗，导致我们在做化学发光检测时，发光底物已经消耗殆尽而形成空斑。   

 减少蛋白上样量、稀释一抗和二抗的浓度。    

六、条带中出现白圈

原因分析    解决方法    

转膜时候，膜与胶之间有气泡。   

解决方法:  制作“三明治”时，注意赶走气泡。通常将电转液倒入一个盘子里，液体高度与第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇一些转膜液，把电泳胶用清水清洗后平铺在滤纸上，随后在确认滤纸与胶之间无气泡后，再往胶上浇一些电转液，之后用双手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜两侧中间，使膜成U型，再将U型底部接触到胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样可以减少气泡。上层滤纸同样用U型的放置方法，可以用玻璃棒贴实一下，然后盖上海绵垫。
   

七、条带拖尾

原因分析    解决方法    

这种情况很容易出现，因为导致条带拖尾的原因很多，可能性较大的是一抗浓度太高，作用时间太长或。   

根据情况调整蛋白量，同时降低一抗的浓度，缩短一抗的时间。    

八、条带变形

原因分析    解决问题
   

胶体中存在气泡，或不溶性杂质，胶不均不平整。  

  配胶时用的小烧杯，水，SDS，tris等等干净无杂质。贴边角加入液体，凝固时避免大幅度动作触碰。    

九、条带呈哑铃装

原因分析及 解决方法    

出现哑铃装条带的问题，最大的可能性就是胶没有配置好，胶凝固后不均一。另外还有一种可能就是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉淀在孔的中间，蛋白被挤到两边。  

  解决方法：把胶配好，不合格的胶坚决不能用。    

十、最边缘条带弯曲

原因分析    解决方法    

电泳电流不均一   

解决方法：换电泳槽，或者不使用两边的孔。

十一、背景非均一性

原因分析及 解决方法    

膜可能干过。    

解决方法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干掉，确保蛋白面不要被风干很长时间，一定要用不漏水的封闭盒并盖上盖子，防止过夜16个小时液体流失。    

十二、条带呈“微笑”或“倒微笑"”状

原因分析及解决问题    

条带呈“微笑U”状，凝胶冷却不均一，电泳槽老化。   

解决方法： 更换电泳槽。
   

条带呈“倒微笑∩”装，凝胶左右两头没有凝固好。
解决方法： 重新制胶。    

十三、其他问题

原因分析及解决方法    

蛋白分子量偏高或者偏低。
  

 可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。
   

蛋白质降解。

   蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
   

所有条带连成一片没有间隔。

   原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。
   

以上是我们对WB条带出现各种状况及解决方法的一个总结，希望可以对大家有所帮助。如果各种原因都试变了，还是做不好WB实验怎么办？

跑出漂亮条带的秘诀，你学会了吗？

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